Tophat中-r/–mate-inner-dist参数

随着测序技术的蓬勃发展，转录组测序中Tophat的应用愈来愈频繁。但是很多论坛，博客等，都在针对Tophat中-r/--mate-inner-dist参数的解释不禁让我觉得有些不妥。

版本一：

-r 比对时两成对引物间的距离中值。比如说，如果你的插入片段有300bp，而每个引物有50bp，那么r值就应该是200=(300+50*2)/2。没有默认值，如果是末端配对比对时这个值是必须的。

版本二：

Tophat有个参数是-r,是用于指定两个末端间未测序部分的宽度的，这个宽度貌似应该这样算：library的长度-2个read的总长度-adapter的总长度

版本三：

The sample was run on a 3% Agarose gel (Nusieve 3:1 Agarose) and a 160 - 380 base pair fragment was cut out and extracted.

在tophat的manual里，有两个参数，-r/--mate-inner-dist <int>和--mate-std-dev <int>，第一个是期望值，第二个是标准差（默认20）。那是不是说第一个参数设为（160+380-2*read_length）/2

于是，开始有很多人询问如何计算引物序列长度，提取接头序列，-r是否应该设置负数。

关于这个参数的上述理解，个人觉得是不精确的，理由如下：

1) 参考Tophat官网中Manual部分对-r/--mate-inner-dist的注释。链接：http://tophat.cbcb.umd.edu/manual.html

-r/--mate-inner-dist <int>  This is the expected (mean) inner distance between mate pairs. For, example, for paired end runs with fragments selected at 300bp, where each end is 50bp, you should set -r to be 200. The default is 50bp.

其中没有任何一个单词是有关引物Primer，或者接头adapter。而是写的在一个fragment中，两个“mate pair”之间的距离，这个不就是插入距离的意思。
后面的那个举例也是想说明：插入距离 = 建库时选择的fragment长度[300bp] - 每一端reads的长度[50bp*2] = 200bp

2)对“the expected (mean)”的解释不应该简单是期待值，确实与另一个参数--mate-std-dev（The standard deviation for the distribution on inner distances between mate pairs. The default is 20bp.）有关联。

因为在测序建库过程中，我们选择的是fragment长度是300bp，但是由于实验过程中一定会存在一个误差范围。虽然期望的是300bp，但是产生的实际fragment长度为290bp,310bp不等，而测序的reads长度是固定长度50bp，所以插入序列长度会出现相应的误差波动。

故，最终fragment长度应该是= 5'reads_length + inner_distance ± standard_deviation + 3'reads_length = 50bp + 200bp ± 20bp + 50bp = 300± 20[bp]

以上为自己的理解，希望大家也一起讨论交流。