Samtools是一个用于操作序列比对结果sam和bam文件的工具合集。
sam文件格式
SAM格式由两部分组成：头部区和比对区，都以tab分列。
头部区:以’@’开始，体现了比对的一些总体信息。比对的SAM格式版本，比对的参考序列，比对使用的软件等。
比对区: 比对结果，每一个比对结果是一行，有11个主列和1个可选列
- @HD VN:1.0 SO:unsorted
- 头部区第一行：VN是格式版本；SO表示比对排序的类型，有unkown(default),unsorted,
- queryname和coordinate几种。samtools软件在进行排序后不能自动更新bam文件的SO值。
- picard却可以。
- @SQ SN:A.auricula_all_contig_1 LN:9401
- 参考序列名。这些参考序列决定了比对结果sort的顺序。SN是参考序列名；LN是参考序列
- 长度;
- @RG ID:sample01
- Read Group. 1个sample的测序结果为1个Read Group；该sample可以有多个library
- 的测序结果。
- @PG ID:bowtie2 PN:bowtie2 VN:2.0.0-beta7
- 比对所使用的软件。
- 比对区11个列和可选列的解释
- 1 QNAME 比对的序列名
- 2 FLAG Bwise FLAG(表明比对类型：pairing，strand，mate strand等)
- 3 RNAME 比对上的参考序列名
- 4 POS 1-Based的比对上的最左边的定位
- 5 MAPQ 比对质量，255表示没有map
- 6 CIGAR Extended CIGAR string (操作符：MIDNSHP) 比对结果信息：匹配碱基数，可变剪接等，*表示不可用。
- 7 MRNM 相匹配的另外一条序列，比对上的参考序列名
- 8 MPOS 1-Based leftmost Mate POsition
- 9 ISIZE 插入片段长度
- 10 SEQ 和参考序列在同一个琏上的比对序列(若比对结果在负意链上，则序列是其反向重复序列)
- 11 QUAL 比对序列的质量(ASCII-33=Phred base quality)
- 12 可选的行，以TAG：TYPE：VALUE的形式提供额外的信息
比对区解释
sam/bam比对区包含有此次比对的结果信息，其中主要信息解释如下：
- FLAG部分
0x800 表明相应位置的比对属于嵌合体比对；
0x4 没有map上的reads；
- CIGAR部分
对于mRNA到基因组的比对，N表示内含子。
More: http://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf
view
-c 计数
-f 返回指定区间/flags比对结果
-q 返回比对质量大于等于指定值的比对数目
-F 4：统计map 上的 reads总数；
-f 4：统计没有map 上的 reads总数；
To get the unmapped reads from a bam file use :
- samtools view -f 4 file.bam > unmapped.sam
the output will be in sam
to get the output in bam use :
- samtools view -b -f 4 file.bam > unmapped.bam
To get only the mapped reads use the parameter ‘F’, which works like -v of grep and skips the alignments for a specific flag.
- samtools view -b -F 4 file.bam > mapped.bam
- samtools view -b -F 4 -f 8 file.bam > onlyThisEndMapped.bam
- samtools view -b -F 8 -f 4 file.bam > onlyThatEndMapped.bam
- samtools view -b -F12 file.bam > bothEndsMapped.bam
- samtools merge merged.bam onlyThisEndMapped.bam onlyThatEndMapped.bam bothEndsMapped.bam
对于tophat比对结果：
- samtools view -b -f 2 accepted_hits.bam > mappedPairs.bam
Better with:
- samtools view -b -f 0x2 accepted_hits.bam > mappedPairs.bam
sort
-m 指定运算内存，支持K，M，G等缩写
-@ 并行运算核数
index
必须对bam文件进行默认情况下的排序后，才能进行index。否则会报错。
建立索引后将产生后缀为.bai的文件，用于快速的随机处理。很多情况下需要有bai文件的存在，特别是显示序列比对情况下。比如samtool的tview命令就需要；gbrowse2显示reads的比对图形的时候也需要。
faidx
对fasta文件建立索引,生成的索引文件以.fai后缀结尾。该命令也能依据索引文件快速提取fasta文件中的某一条（子）序列。
See more： bedtools 使用小结
flagstat
给出BAM文件的比对结果
- $ samtools flagstat example.bam
- 11945742 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
- #总共的reads数
- 0 + 0 duplicates
- 7536364 + 0 mapped (63.09%:-nan%)
- #总体上reads的匹配率
- 11945742 + 0 paired in sequencing
- #有多少reads是属于paired reads
- 5972871 + 0 read1
- #reads1中的reads数
- 5972871 + 0 read2
- #reads2中的reads数
- 6412042 + 0 properly paired (53.68%:-nan%)
- #完美匹配的reads数：比对到同一条参考序列，并且两条reads之间的距离符合设置的阈值
- 6899708 + 0 with itself and mate mapped
- #paired reads中两条都比对到参考序列上的reads数
- 636656 + 0 singletons (5.33%:-nan%)
- #单独一条匹配到参考序列上的reads数，和上一个相加，则是总的匹配上的reads数。
- 469868 + 0 with mate mapped to a different chr
- #paired reads中两条分别比对到两条不同的参考序列的reads数
- 243047 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)
mpileup
samtools还有个非常重要的命令mpileup，以前为pileup。该命令用于生成bcf文件，再使用bcftools进行SNP和Indel的分析。bcftools是samtool中附带的软件，在samtools的安装文件夹中可以找到。
-f 来输入有索引文件的fasta参考序列；
-g 输出到bcf格式。
贡献来源
http://www.plob.org/2014/01/26/7112.html
http://blog.sina.com.cn/s/blog_670445240101l30k.html
https://www.biostars.org/p/56246/
https://www.biostars.org/p/110039/
https://www.biostars.org/p/95929/
https://www.biostars.org/p/110157/
https://groups.google.com/forum/#!forum/bedtools-discuss
https://code.google.com/p/hydra-sv/