使用cnvkit来对大批量wes样本找cnv

cnvkit被设计来处理同一个批次的多个肿瘤配对样本测序情况，首先对所有的normal数据进行bin处理拿到背景值，然后就这个背景值来处理所有的tumor测序数据计算拷贝数变异情况。

该软件使用比较复杂，建议读一读官网教程。所有的命令都被包装到一个python脚本里面，使用该脚本调用一系列字命令，如下：

• 官网教程

• Copy number calling pipeline
  • batch
  • target
  • access
  • antitarget
  • autobin
  • coverage
  • reference
  • fix
  • segment
  • call
    • Transformations
    • Calling methods
    • Allele frequencies and counts
    • Filtering segments

每个命令都有自己的特殊功能，需要仔细阅读。

流程图：

流程代码如下：

cnvkit.py access baits.bed --fasta hg19.fa -o access.hg19.bed
cnvkit.py autobin *.bam -t baits.bed -g access.hg19.bed [--annotate refFlat.txt --short-names]
​
# For each sample...
cnvkit.py coverage Sample.bam baits.target.bed -o Sample.targetcoverage.cnn
cnvkit.py coverage Sample.bam baits.antitarget.bed -o Sample.antitargetcoverage.cnn
​
# With all normal samples...
cnvkit.py reference *Normal.{,anti}targetcoverage.cnn --fasta hg19.fa [--male-reference] -o my_reference.cnn
​
# For each tumor sample...
cnvkit.py fix Sample.targetcoverage.cnn Sample.antitargetcoverage.cnn my_reference.cnn -o Sample.cnr
cnvkit.py segment Sample.cnr -o Sample.cns
​
# Optionally, with --scatter and --diagram
cnvkit.py scatter Sample.cnr -s Sample.cns -o Sample-scatter.pdf
cnvkit.py diagram Sample.cnr -s Sample.cns [--male-reference] -o Sample-diagram.pdf

可以看到软件提供的命令基本上的都用到了，coverage—>fix—>segment—>segment

其实上面这么一大串的命令已经被包装成了一句命令，就是：

cnvkit.py batch *.bam -r my_reference.cnn -p 8

这个一句话命令与上面的多行代码是等效的，默认的segment算法是 circular binary segmentation algorithm (CBS)，也可以用-m切换使用其它算法，比如： faster HaarSeg (haar) or Fused Lasso (flasso)

上面得到的只是segment的结果，还可以call一下：

cnvkit.py call Sample.cns -o Sample.call.cns
cnvkit.py call Sample.cns -y -m threshold -t=-1.1,-0.4,0.3,0.7 -o Sample.call.cns
cnvkit.py call Sample.cns -y -m clonal --purity 0.65 -o Sample.call.cns
cnvkit.py call Sample.cns -y -v Sample.vcf -m clonal --purity 0.7 -o Sample.call.cns

这个时候需要考虑到已有的vcf变异文件，或者计算好的tumor纯度，或者倍性等等。把segment计算得到的log2 ratio值还原成 0,1,2,3,4这样的拷贝数。

但是，事实上上面的代码一般来说是不能直接使用的，因为我们的测序数据通常是WES数据，需要加上很多参数。

实践运行cnvkit

上面流程很复杂，命令也很多，但是不知道也没关系，用起来其实就一个batch命令即可，当然这个batch命令本身参数也不少，而且被设计用来处理不同的数据情况。

# From baits and tumor/normal BAMs
## 同一批次的所有样本N/T测序数据的bam文件一起运行
cnvkit.py batch *Tumor.bam --normal *Normal.bam \
    --targets my_baits.bed --annotate refFlat.txt \
    --fasta hg19.fasta --access data/access-5kb-mappable.hg19.bed \
    --output-reference my_reference.cnn --output-dir results/ \
    --diagram --scatter
​
## 如果新增加了肿瘤测序数据，就运行下面的
# Reusing a reference for additional samples
cnvkit.py batch *Tumor.bam -r Reference.cnn -d results/
​
# Reusing targets and antitargets to build a new reference, but no analysis
cnvkit.py batch -n *Normal.bam --output-reference new_reference.cnn \
    -t my_targets.bed -a my_antitargets.bed --male-reference \
    -f hg19.fasta -g data/access-5kb-mappable.hg19.bed

值得注意的就是，如果是全基因组测序数据，用batch --method wgs ，如果是捕获基因组测序，包括全外显子，就用 batch --method amplicon ，然后一定要提供捕获区域的bed文件，一般是外显子加上其侧翼上下游的50bp长度。

人类外显子长度平均是200bp，所以默认的bin是267bp，这样可以把比较长的exon给拆分开来。

还有就是 access 参数需要的文件，

至于最后得到cnv片段该如何注释到对应区域的基因这种小事，就不在本文讨论范围啦。

输入输出文件

其中 coverage 命令会对每一个 normal 样本都计算 *.targetcoverage.cnn and *.antitargetcoverage.cnn files , 说明是： target and antitarget coverage tables (.cnn)

这些文件需要合并起来：

cnvkit.py reference *coverage.cnn -f ucsc.hg19.fa -o Reference.cnn

然后再校正区域测序深度及GC含量，之后变成 copy number ratios (.cnr) 文件。

cnvkit.py fix Sample.targetcoverage.cnn Sample.antitargetcoverage.cnn Reference.cnn -o Sample.cnr

最后把 copy number ratios (.cnr) 文件用segment算法跑一下即可，输出cns后缀文件的 segment信息。

对于normal样本只需要输出cnn即可，合并成Reference.cnn，然后把一个个tumor样品，根据这个Reference.cnn来计算 cnr，进而计算 cns 。

最后对于cns可以进行call找到真正的拷贝数。

可以看到 cns文件内容如下，其中第4列是注释的基因，因为太多，看不清楚，我就没有秀给大家。

$ head  NPC_merge_marked_fixed.cns |cut -f 1-3,5,8
chromosome  start   end log2    weight
chr1    12098   1701806 -0.183469   84.0794
chr1    1702902 1752401 -0.962192   4.87216
chr1    1752901 12777601    -0.220165   370.756
chr1    12778101    12920301    -1.11688    10.7699
chr1    12920307    27407686    -0.275998   558.214
chr1    27408186    125184087   -0.0447404  2418.53
chr1    143185087   248945922   -0.0422629  2967.61
chr2    10500   5692985 0.151978    85.3751
chr2    5692985 90402011    -0.0329165  1874.56

上面的segment结果还可以call一下，如果有需要的话。

可视化结果：

很明显可以看到有拷贝数变异的区域了。