简化基因组数据分析实战

RAD-seq和GBS是什么关系

简化基因组的测序方法

RAD-Seq(restriction site-associated DNA sequencing)最开始指的是2008年发表在PLOS ONE上“Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers”提出的方法，目前该文章的引用已经达到1200 ，现在指代的是一系列基于限制性内切酶的测序技术。同样在概念上被引申的还有GBS(genotyping-by-sequencing),只不过GBS的名字不能让你直接把它和限制性内切酶联想起来.总之，如果现在公司给你推荐GBS或RAD-seq时，可能未必和你想的一样，你需要仔细问下他们的建库手段。毕竟手段不同，你的实验设计，操作和结果都会发生变化。这是RAD-seq相关方法的历年引用情况

RAD-seq虽说方法很多，但是文库构建流程大致如下，不同方法在其中某些步骤存在差异

• 起始基因组DNA量：能否允许降解FNA
• 限制性内切酶酶解：限制酶种类，数量
• 酶切位点结合接头：接头类型
• 酶解片段大小选择：直接选择，间接选择
• 添加barcode混池：视v接头而异
• 测序类型选择：单端，双端

两者的差异在于，1）是现进行酶切然后随机破碎，最后仅选择存在酶切位点片段测序；2）也是酶切，但是后续直接选择合适大小的片段测序。

因此相对于1）测序的位点平均会少一点，也就会导致同一批样本后者利用率低于前者。无参考基因组更推荐前者，而不是后者。

原始RAD-seqs

最先提出的RAD-seq技术流程，也就是RAD-seq的冠名技术，分为如下几步：

1. 基因组DNA用限制性内切酶裂解， 然后连接到P1接头。P1接头里含有正向扩增和Illumina测序引物位点，以及4~5 bp 的核酸barcode. barcode至少大于3 bp。
2. 之后接头连接的片段(adapter-ligated fragments)混池，随机打断
3. DNA随后连接到P2接头，反向扩增扩展引物无法连接P2. P2是一种Y型接头，包含P2反向扩增引物位点的反向互补序列，使得不含P1接头的片段无法扩增。(Y型接头的工作原理)
4. 最后仅有同时含P1和P2接头的片段能够上机测序。

Genotyping-by-Sequencing

GBS比原始的RAD-seq步骤更加简单

1. 将不同样本和含不同barcode接头成对放在平板里
2. 使用ApeKI限制酶进行酶解
3. 使用T4连接酶，将接头连接到片段两端因酶切产生的粘末端（stcky end）
4. 将含不同barcode的样本混池，随后过片段长度筛选柱，过滤尚未反应的接头
5. 加入PCR引物，进行PCR扩增

这里没有直接对片段进行筛选，但是PCR扩增时优先扩增小片段

Genotyping-by-Sequencing流程

ddRAD-seq

ddRAD-seq和GBS相似，两者都不需要在加接头后进行随机打碎，GBS通过PCR扩增的方式过滤了大片段，而ddRAD-seq通过双酶切的方式，然后筛选固定长度来选择合适大小的片段

ddRAD-seq和RAD-seq的不同

常见方法的比较

其实这些RAD-seq文库制备方法可以简单的分为两类：

• 1）对单酶切位点邻近片段测序，如最初的RAD-seq
• 2）对酶切位点两翼片段测序，如Genoytping-by-Sequencing

下面是常见的物RAD-seq方法比较

参考文献

• RAD-seq: Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers
• GBS: A Robust, Simple Genotyping-by-Sequencing (GBS) Approach for High Diversity Species
• ddRAD-seq: Double Digest RADseq: An Inexpensive Method for De Novo SNP Discovery and Genotyping in Model and Non-Model Species
• 2011 NATURE REVIEWS | GENETICS：Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation
• 2016 NATURE REVIEWS | GENETICS：Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics

数据处理

尽管目前已经有大量物种基因组释放出来，但还是存在许多物种是没有参考基因组。使用基于酶切的二代测序技术，如RAD-seq，GBS，构建遗传图谱是研究无参考物种比较常用的方法。Stacks就是目前比较通用的分析流程，能用来构建遗传图谱，处理群体遗传学，构建进化发育树。

这篇教程主要介绍如何使用Stacks分析基于酶切的二代测序结果，比如说等RAD-seq，分析步骤为环境准备，原始数据质量评估， 多标记数据分离，序列比对（无参则需要进行contig de novo 组装），RAD位点组装和基因分型，以及后续的标记过滤和格式转换。

适用范围：

• 酶切文库类型：ddRAD, GBS, ezRAD, quad-dRAD和Rapture。 但是stacks更适用于RAD-seq，GBS推荐TASSEL。如下是“Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation sequencing”对几种常见的建库方法的总结

• 测序类型： 双酶切文库双端测序数据或单端数据
• 测序平台： illumina，  IonTorren

局限性：

• 不能用于普通的随机文库测序
• 不能适用单酶切文库的双端测序数据（stacks 2.0可以）
• 无法用于混池测序，也不适合与多倍体，因为stacks在组装时假定物种为二倍体
• 对于深度不够，且错误率比较高的数据，它也没辙，所以建议深度在20x以上

分析者要求：掌握基本的Unix命令行，会基本集群操作，熟悉R语言编程。

硬件要求：电脑的内存在64G以上，8～16核CPU起步，准备1T以上的硬盘。

前期准备

准备分为两个部分：软件安装和数据下载。

数据准备： 数据来自于2012年发表的”The population structure and recent colonization history of Oregon threespine stickleback determined using restriction-site associated DNA-sequencing”中的三刺鱼( Gasterosteus aculeatus )数据集，一共有78个样本，来自于美国俄勒冈海岸的4个群体，两个是海水鱼（Cushman Slough’ (CS)和 ‘South Jetty’ (SJ)），两个是淡水鱼（‘Winchester Creek’ (WC) 和 ‘Pony Creek Reservoir’ (PCR)）。

mkdir -p stacks-exercisecd stacks-exercise
wget -q http://catchenlab.life.illinois.edu/data/rochette2017_gac_or.tar.gz
tar xf http://catchenlab.life.illinois.edu/data/rochette2017_gac_or.tar.gz

这个数据大约在9G左右，因此需要很长一段时间，这段时间可以安装软件。

软件安装：需要安装BWA, SAMtools, stacks,R/ADEgenet. 好消息是这些软件都可以通过bioconda进行安装，除了R/ADEgenet推荐直接用R的install.packages("adegenet")

# 适用conda安装软件conda install -c bioconda bwa
conda install -c bioconda samtools
conda install -c bioconda stacks=1.47

估计此时数据依旧没有下载完，我们先创建后续需要用到的文件目录

mkdir -p stacks-exercise/{00-raw-data,01-clean-data,02-read-alignment,reference/genome,stacks/{de-novo,ref},test/{de-novo,ref},info}# 目录结构stacks-exercise/
|-- 00-raw-data # 原始数据|-- 01-clean-data # 处理后数据|-- 02-read-alignment # 比对后数据|-- info # barcode信息|-- reference # 参考基因组|   |-- genome
|-- rochette2017_gac_or.tar.gz
|-- stacks # 实际运行|   |-- de-novo
|   |-- ref
|-- test # 测试数据集|-- de-novo
|-- ref

准备输入文件（可选）

这一步并非必须，取决公司提供给你什么样的数据。对于多个样本测序，公司可能返还的是含有barcode信息原始lane数据，那么就需要从原始数据中将各个样本的数据区分开。

先将解压得到的三个lane的原始数据移动到我们的文件夹中，

cd stacks-exercise
mv rochette2017_gac_or/top/raw/{lane1,lane2,lane3} 00-raw-data

接着准备两个制表符（Tab）分隔的文件，用于将barcode和样本对应，以及样本和群体一一对应。这里不需要自己写了，只需要将作者存放info里的tsv文件复制过来即可，格式如下

mv rochette2017_gac_or/top/info/*.tsv info/# barcode和样本的对应关系head -n3 info/barcodes.lane1.tsv
CTCGCC  sj_1819.35GACTCT  sj_1819.31GAGAGA  sj_1819.32# 样本和群体的对应关系head -n3 info/popmap.tsv
cs_1335.01  cs
cs_1335.02  cs
cs_1335.03  cs

关barcode和样本的tsv中，样本的命名里不要包含空格，只能用字母，数字，”.”,“-”和”_”, 而且有意义，最好包含原来群体名的缩写和样本编号。

可视化评估测序数据

思考并记录下按照你的实验处理，你得到的read大概会是什么结构，从理论上讲，从左往右应该分别是：barcode，限制性酶切位点和后续的测序碱基。比如说案例应该现有6个碱基的barcode，SbfI限制性位点CCTGCAGG和其余的DNA序列，总计101bp

<6-nt barcode>TGCAGG

然后我们就可以用Linux自带的文本处理命令检查一下，比如说grep/zgrep，zcat head, less/zless.

如果序列已经去掉了barcode，那么开头的就会是酶切位点。

第一步：数据预处理

这一步会用到process_radtags, 它负责对原始的数据进行处理，包括样本分离，质量控制，检查酶切位点完整性等。

# 在项目根目录下raw_dir=00-raw-data/lane1
barcodes_file=info/barcodes.lane1.tsv
process_radtags -p $raw_dir -b $barcode_file \
-o 01-clean-data/ -e sbfI --inline_null \
-c -q -r &> 01-clean-data/process_radtags.lane1.oe &

解释下参数，虽然大部分已经很明了：

-p为原始数据存放文件夹

-b为barcode和样本对应关系的文件

-o为输出文件夹

-e为建库所用的限制性内切酶

--inline_null表示barcode的位置在单端的read中

-c表示数据清洗时去除表示为N的碱基

-q表示数据清理时要去除低质量碱基

-r表示要抢救下barcode和RAD-tag。

这一步需要留意自己的单端测序，还是双端测序，barcode是在read中，还是在FASTQ的header中，是否还需要去接头序列，是否是双酶切建库等。
另外这一步比较耗时，尽量脱机运行或者提交到计算节点中，不然突然断网导致运行终止就更浪费时间了。
将运行结果记录到日志文件中，方便后期检查报错。

运行结束后，在01-clean-data下会有除了process_radtags.lane1.oe外，还会有process_radtags.lane1.log，前者记录每条lane的数据保留情况，后者记录每个样本的数据保留情况。可以将后者复制到Excel表格中，用柱状图等方法直观了解

从图中可以发现,”sj_1483.05”和”sj_1819.31”几乎没有read留下来，这能是建库上导致的问题，我们需要将其从“info/popmap.tsv”中删掉或者用“#”注释掉（推荐后者）。

在数据预处理这一步，stacks还提供process_shortreads，clone_filter， kmer_filter用于处理cDNA文库和随机切割的DNA文库，如果是RAD-seq不需要用到。

如果是双端测序，stacks1.47只能通过cat合并两个数据，而不能有效的利用双端测序提供的fragment信息。stacks似乎可以，我之后尝试。

后续就要区分为有参和无参两条路了。

参考资料

• Deriving genotypes from RAD-seq short-read data using Stacks
• Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation sequencing

第二步：序列比对

这一步之后，分析流程就要根据是否有参考基因组分别进行分析。无参考基因组需要先有一步的 de novo 组装，产生能用于比对的contig。有参考基因组则需要考虑基因组的质量，如果质量太差，则需要进一步以无参分析作为补充。

参考基因组主要用于区分出假阳性的SNP，将snp与附近其他共线性的snp比较来找出离异值，这些离异值大多是因为建库过程所引入的误差，如PCR的链偏好性扩增。

无论是何者，我们一开始都只能用其中的部分数据进行参数测试，根据不同的参数结果作为反馈，进行调优，这一步根据你的运气和经验，还有你的算力，时间不定。毕竟超算一天，普算一年。

有参考基因组

三刺鱼是可从ensemblgenomic上搜索到到参考基因组信息

• http://asia.ensembl.org/Gasterosteus_aculeatus/Info/Index

但是质量非常一般，仅仅是contig程度，只能说是凑合使用了。

建立索引数据库

stacks不直接参与比对，而是处理不同比对软件得到的BAM文件，因此你可以根据自己的喜好选择比较工具。目前，基因组比对工具都是首选BWA-mem，所以这里建立bwa的索引

# 位于项目根目录下
cd reference/genome
wget -q ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-91/fasta/gasterosteus_aculeatus/dna/Gasterosteus_aculeatus.BROADS1.dna.toplevel.fa.gz
gzip -d Gasterosteus_aculeatus.BROADS1.dna.toplevel.fa.gzcd ..
mkdir -p index/bwa/
genome_fa=genome/Gasterosteus_aculeatus.BROADS1.dna.toplevel.fa
bwa index -p index/bwa/gac $genome_fa &> index/bwa/bwa_index.oe
# 结果如下
|-- genome
|   |-- Gasterosteus_aculeatus.BROADS1.dna.toplevel.fa
|-- index
    |-- bwa
        |-- bwa_index.oe
        |-- gac.amb
        |-- gac.ann
        |-- gac.bwt
        |-- gac.pac
        |-- gac.sa

小样本参数调优

这一步是为了调整比对工具处理序列相似性的参数，保证有绝大多数的read都能回帖到参考基因组上，因此参数不能太严格，能容忍遗传变异和测序误差，也不能太宽松，要区分旁系同源位点。对于BWA-MEM而言，几个和打分相关的参数值得注意:

• -B: 不匹配的惩罚, 影响错配数，默认是4
• -O: 缺失和插入的gap打开的惩罚，影响InDel的数目，默认是[6,6]
• -E: gap延伸的惩罚，长度k的gap惩罚为’{-O} {-E}*k’， 默认是[1,1]
• -L: soft clip的惩罚，也就是read两端直接切掉碱基来保证匹配，默认是[5,5]

对于参考基因组质量比较高，且研究物种和参考基因组比较近，那么参数调整没有太大必要性。如果质量不要，或者所研究物种和参考基因组有点距离，那么就需要注意不同参数对结果的影响，必要时使用IGV人工检查。

让我们先以默认参数开始，处理其中一个样本

# 位于项目根目录下# 在测试文件下按照参数创建文件夹
mkdir -p test/ref/{alignment-bwa,stacks-bwa}
## bwa-mem比对
sample=cs_1335.01fq_file=01-clean-data/$sample.fq.gz
bam_file=test/ref/alignment-bwa/${sample}_default.bam
bwa_index=reference/index/bwa/gac
bwa mem -M $bwa_index $fq_file | samtools view -b > $bam_file &

这里的bwa mem使用了-M参数，通常的解释这个参数是为了和后续的Picard标记重复和GATK找变异兼容。

进一步的解释，不用-M,split read会被标记为SUPPLEMENTARY, 使用该选项则是标记为SECONDARY（次要），即不是PRIMARY（主要），既然不是主要比对，所以就被一些工具忽略掉。如果是SUPPLEMENTARY就有可能在标记重复时被考虑进去。其中split read是嵌合比对的一部分，具体概念见SAM格式解释。

对于比对结果，可以用samtools stats和samtools flagstat查看一下质量

samtools flagstat test/ref/alignment-bwa-default/cs_1335.01_default.bam
#1310139   0 in total (QC-passed reads   QC-failed reads)
#7972   0 secondary
#0   0 supplementary
#0   0 duplicates#1271894   0 mapped (97.08% : N/A)

97.08%的比对率应该是很不错了，不过可以尝试降低下错配和gap的惩罚，看看效果

# 位于项目根目录下
sample=cs_1335.01fq_file=01-clean-data/$sample.fq.gz
bam_file=test/ref/alignment-bwa/${sample}_B3_O55.bam
bwa_index=reference/index/bwa/gac
bwa mem -M -B 3 -O 5,5 $bwa_index $fq_file | samtools view -b > $bam_file &
samtools flagstat test/ref/alignment-bwa-default/cs_1335.01_default.bam
#1309830   0 in total (QC-passed reads   QC-failed reads)
#7663   0 secondary
#0   0 supplementary
#0   0 duplicates#1272297   0 mapped (97.13% : N/A)

也就提高了0.05%，所以就用默认参数好了。通过IGV可视化，可以了解简化基因组的read分布是比较稀疏，10k中可能就只有2个。

得到的BAM文件使用pstack中找snp，

# 位于项目根目录下
sample=cs_1335.01
sample_index=1
bam_file=test/ref/alignment-bwa/${sample}_B3_O55.bam
log_file=test/ref/stacks-bwa/$sample.pstacks.oe
pstacks -t bam -f $bam_file -i $sample_index -o test/ref/stacks-bwa/ &> $log_file

这里的参数也很简单，-t用来确定输入文件的格式,-f是输入文件,-i对样本编序，-o指定输出文件夹。除了以上几个参数外，还可用-p指定线程数，-m来制定最低的覆盖度，默认是3.还可以用--model_type [type]制定模型。

最后得到$sample.tags.tsv.gz, $sample.models.tsv.gz, $sample.snps.tsv.gz, 和 $sample.alleles.tsv.gz共4个文件，以及一个日志文件。参数评估的主要看日志文件里的几个指标：

• 实际使用的alignment数
• 因soft-clipping剔除的alignment数，过高的话要对比对参数进行调整
• 每个位点的平均覆盖度，过低会影响snp的准确性。

这里仅仅用了一个样本做测试，实际上要用10个以上样本做测试，看平均表现，

全数据集处理

在使用小样本调试完参数，这部分参数就可以应用所有的样本。除了比对和使用pstacks外，还需要用到 cstacks根据位置信息进一步合并成包含所有位点信息的目录文件，之后用 sstacks从 cstacks创建的目录文件搜索每个样本的位点信息。代码为

cstacks -p 10 --aligned -P 03-alignment-stacks/ -M info/popmap.tsv
# 以其中一个样本为例
sample=cs_1335.01
log_file=$sample.sstacks.oe
sstacks --aligned -c 03-alignment-stacks/batch_1 -s 03-alignment-stacks/$sample -o 03-alignment-stacks/ &> 03-alignment-stacks/$log_file

你可以写一个shell脚本处理，不过我现在偏好用snakemake写流程，如下：

INDEX = "reference/index/bwa/gac"

SAMPLES, = glob_wildcards("01-raw-data/{sample}.fq.gz")

INDEX_DICT = {value: key for key, value in dict(enumerate(SAMPLES, start=1))}

FQ_FILES = expand("01-clean-data/{sample}.fq.gz", sample=SAMPLES)

BAM_FILES = expand("02-read-alignment/ref-based/{sample}.bam", sample=SAMPLES)

SNP_TSVS = expand("03-alignment-stacks/{sample}.snp.tsv.gz", sample=SAMPLES)

CATALOG = "03-alignment-stacks/batch_1.catalog.snps.tsv.gz"

MATCHES = expand("03-alignment-stacks/{sample}.matches.tsv.gz", sample=SAMPLES)

rule all:

 input:

 BAM_FILES,


rule bwa_mem:

 input: "01-clean-data/{sample}.fq.gz"

 params:

 index = INDEX,

 mismatch = "3",

 gap = "5,5"

 threads: 8

 output: "02-read-alignment/ref-based/{sample}.bam"

 shell:"""

 mkdir -p 02-read-alignment

 bwa mem -t {threads} -M -B {params.mismatch} -O {params.gap} {params.index} {input} \

 | samtools view -b > {output}

 """


 rule pstacks:

 input: "02-read-alignment/ref-based/{sample}.bam"

 params:

 index = lambda wildcards: INDEX_DICT.get(wildcards.sample),

 outdir = "03-alignment-stacks/"

 threads: 8

 output:

 "03-alignment-stacks/{sample}.snps.tsv.gz",

 "03-alignment-stacks/{sample}.tags.tsv.gz",

 "03-alignment-stacks/{sample}.models.tsv.gz",

 "03-alignment-stacks/{sample}.alleles.tsv.gz"

 log: "03-alignment-stacks/{sample}.pstacks.oe"

 shell:"""

 mkdir -p 03-alignment-stacks

 pstacks -p {threads} -t bam -f {input} -i {params.index} -o {params.outdir} &> {log}

 """

# A catalog can be built from any set of samples processed by the ustacks or pstacks programs

rule cstacks:

 input: "info/popmap.tsv",expand("03-alignment-stacks/{sample}.snps.tsv.gz", sample=SAMPLES)

 threads: 10

 output:

 "03-alignment-stacks/batch_1.catalog.alleles.tsv.gz",

 "03-alignment-stacks/batch_1.catalog.snps.tsv.gz",

 "03-alignment-stacks/batch_1.catalog.tags.tsv.gz"

 shell:

 "cstacks -p {threads} --aligned -P 03-alignment-stacks/ -M {input[0]}"


# Sets of stacks, i.e. putative loci, constructed by the ustacks or pstacks programs

# can be searched against a catalog produced by cstacks.

rule sstacks:

 input:

 "03-alignment-stacks/{sample}.snps.tsv.gz",

 "03-alignment-stacks/{sample}.tags.tsv.gz",

 "03-alignment-stacks/{sample}.models.tsv.gz",

 "03-alignment-stacks/{sample}.alleles.tsv.gz"

 params:

 catalog = "03-alignment-stacks/batch_1",

 sample = lambda wildcards: "03-alignment-stacks/"   wildcards.sample

 output:

 "03-alignment-stacks/{sample}.matches.tsv.gz"

 log: "03-alignment-stacks/{sample}.sstacks.oe"

 shell:"""

 sstacks --aligned -c {params.catalog} -s {params.sample} -o 03-alignment-stacks &> {log}

 """

将以上代码保存为Snakemake，没有集群服务器，就直接用 snakemake运行吧。因为我能在集群服务器上提交任务，所以用如下代码：

snakemake --cluster "qsub -V -cwd" -j 20 --local-cores 10 &

无参考基因组分析

基于参考基因组的分析不能体现出RAD-seq的优势，RAD-seq的优势体现在没有参考基因组时他能够提供大量可靠的分子标记，从而构建出遗传图谱，既可以用于基因定位，也可以辅助组装。

和全基因组随机文库不同，RAD-seq是用限制性内切酶对基因组的特定位置进行切割。这样的优点在于降低了 de novo 组装的压力，原本是根据overlap（重叠）来延伸150bp左右短读序列，形成较大的contig，而现在只是将相似性的序列堆叠(stack)起来。这样会产生两种分子标记：1）由于变异导致的酶切位点出现有或无的差异；2）同一个酶切位点150bp附近存在snp。

参数调优

这一步使用的核心工具是 ustacks和 cstacks,前者根据序列相似性找出变异，后者将变异汇总，同样需要使用小样本调整三个参数 -M, -n, -m。 ustacks的 M 控制两个不同样本等位基因（allele）之间的错配数，m 控制最少需要几个相同的碱基来形成一个堆叠（stack).最后一个比较复杂的参数是能否允许gap(--gap)。而 cstacks的 n 和 ustacks的 M等价。

因此，我们可以尝试在保证 m=3的前提，让 M=n从1到9递增，直到找到能让80%的样本都有多态性RAD位点，简称r80. Stacks提供了 denovo_map.pl来完成这部分工作，下面开始代码部分。

首先是从 info/popmap.tsv中挑选10多个样本用于参数调试。

cat popmap_sample.tsv

cs_1335.01 cs
cs_1335.02 cs
cs_1335.19 cs
pcr_1193.00 pcr
pcr_1193.01 pcr
pcr_1193.02 pcr
pcr_1213.02 pcr
sj_1483.01 sj
sj_1483.02 sj
sj_1483.03 sj
wc_1218.04 wc
wc_1218.05 wc
wc_1218.06 wc
wc_1219.01 wc

然后为每个参数都准备一个文件夹

mkdir -p test/de-novo/stacks_M{1..9}

然后先 测试 第一个样本

# 项目根目录

M=1

popmap=info/popmap_sample.tsv

reads_dir=01-clean-data

out_dir=test/de-novo/stacks_M${M}

log_file=$out_dir/denovo_map.oe

threads=8

denovo_map.pl -T ${threads} --samples ${reads_dir} -O ${popmap} -o ${out_dir} -M $M -n $M -m 3 -b 1 -S &> ${log_file} &

代码运行需要一段比较长的时间，这个时候可以学习一下参数： -T 表示线程数， --samples表示样本数据所在文件夹，-O提供需要分析的样本名， -o是输出文件夹，之后就是-M, -n, -m这三个需要调整的参数， -b表示批处理的标识符， -S关闭SQL数据库输出。同时还有遗传图谱和群体分析相关参数，-p表示为亲本，-r表示为后代，-s表明群体各个样本。

为了确保下一步能顺利进行，还需要对oe结尾的日志文件的信息进行检查,确保没有出错

grep -iE "(err|e:|warn|w:|fail|abort)" test/de-novo/stacks_M1/denovo_map.oe

以及以log结尾的日志中每个样本的平均覆盖度，低于10x的覆盖度无法保证snp的信息的准确性

之后对每个参数得到的原始数据，要用 populations过滤出80%以上都有的snp位点，即r80位点

# 项目根目录

for M in `seq 1 9`

do

popmap=info/popmap_sample.tsv

stacks_dir=test/de-novo/stacks_M${M}

out_dir=$stacks_dir/populations_r80

mkdir -p ${out_dir}

log_file=$out_dir/populations.oe

populations -P $stacks_dir -O $out_dir -r 0.80 &> $log_file &

done

确定参数

经过漫长的等待后，所有参数的结果都已经保存到特定文件下，最后就需要从之确定合适的参数，有两个指标：

• 多态性位点总数和r80位点数
• 短读堆叠区的snp平均数

尽管这些信息都已经保存在了相应的文本 test/de-novo/stacks_M[1-9]/populations_r80/batch_1.populations.log中，但是通过文字信息无法直观的了解总体情况，因此更好的方法是用R处理输出绘图结果。

第一步：提取每个参数输出文件中的log文件中SNPs-per-locus distribution（每个位点座位SNP分布图）信息.新建一个shell脚本，命名为，log_extractor.sh, 添加如下内容

#!/bin/bash

# Extract the SNPs-per-locus distributions (they are reported in the log of populations).

# ----------

echo "Tallying the numbers..."

full_table=n_snps_per_locus.tsv

header=\'#par_set\tM\tn\tm\tn_snps\tn_loci\'

for M in 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ;do

 n=$M

 m=3

 # Extract the numbers for this parameter combination.

 log_file=test/de-novo/stacks_M${M}/populations_r80/batch_1.populations.log

 sed -n \'/^#n_snps\tn_loci/,/^[^0-9]/ p\' $log_file | grep -E \'^[0-9]\' > $log_file.snps_per_loc

 # Cat the content of this file, prefixing each line with information on this

 # parameter combination.

 line_prefix="M$M-n$n-m$m\t$M\t$n\t$m\t"

 cat $log_file.snps_per_loc | sed -r "s/^/$line_prefix/"

done | sed "1i $header" > $full_table

运行后得到 n_snps_per_locus.tsv用于后续作图。会用到两个R脚本 plot_n_loci.R和 plot_n_snps_per_locus.R，代码见最后，结果图如下

从上图可以发现M=4以后，折线就趋于稳定，并且每个座位上的SNP分布趋于稳定，因此选择M=4作为全样本数据集的运行参数。

和之前基于参考基因组分析的代码类型，只不过将序列比对这一块换成了 ustacks。尽管前面用来确定参数的脚本 denovo_map.pl也能用来批量处理，但它不适合用于大群体分析。 ustacks得到的结果仅能选择40～200个 覆盖度高 且 遗传多样性上有代表性的样本。 使用所有样本会带来计算上的压力，低频的等位基因位点也并非研究重点，并且会提高假阳性。综上，选择覆盖度比较高的40个样本就行了。

总体部分已经通过这三天讲完，明后天更新SNP过滤部分

Snakefile：

SAMPLES, = glob_wildcards("01-clean-data/{sample}.fq.gz")

INDEX_DICT = {value: key for key, value in dict(enumerate(SAMPLES, start=1)).items()}

FQ_FILES = expand("01-clean-data/{sample}.fq.gz", sample=SAMPLES)

# de novo

MISMATCH = 4 # mismatch number of ustacks

DE_NOVO_LOCI = expand("03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.snps.tsv.gz", sample=SAMPLES)

DE_NOVO_CATA = "03-stacks-analysis/de-novo/batch_1.catalog.snps.tsv.gz"

DE_NOVO_MATS = expand("03-stacks-analysis/de-nono/{sample}.matches.tsv.gz", sample=SAMPLES)

# ref-based

INDEX = "reference/index/bwa/gac"

BAM_FILES = expand("02-read-alignment/ref-based/{sample}.bam", sample=SAMPLES)

REF_BASED_LOCI = expand("03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.snps.tsv.gz", sample=SAMPLES)

REF_BASED_CATA = "03-stacks-analysis/ref-based/batch_1.catalog.snps.tsv.gz"

REF_BASED_MATS = expand("03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.matches.tsv.gz", sample=SAMPLES)



rule all:

 input: rules.de_novo.input, rules.ref_based.input


rule de_novo:

 input: DE_NOVO_LOCI, DE_NOVO_CATA,DE_NOVO_MATS


rule ref_based:

 input: REF_BASED_LOCI, REF_BASED_CATA, REF_BASED_MATS


# de novo data analysis

## The unique stacks program will take as input a set of short-read sequences

## and align them into exactly-matching stacks (or putative alleles).

rule ustacks:

 input: "01-clean-data/{sample}.fq.gz"

 threads: 8

 params:

 mismatch = MISMATCH,

 outdir = "03-stacks-analysis/de-novo",

 index = lambda wildcards: INDEX_DICT.get(wildcards.sample)

 output:

 "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.snps.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.tags.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.models.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.alleles.tsv.gz",

 log: "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.ustacks.oe"

 shell:"""

 mkdir -p {params.outdir}

 ustacks -p {threads} -M {params.mismatch} -m 3 \

 -f {input} -i {params.index} -o {params.outdir} &> {log}

 """


## choose sample for catalog building

rule choose_representative_samples:

 input: expand("03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.ustacks.oe", sample=SAMPLES)

 output:

 "03-stacks-analysis/de-novo/per_sample_mean_coverage.tsv",

 "info/popmap.catalog.tsv"

 shell:"""

 for sample in {input};do

 name=${{sample##*/}}

 name=${{name%%.*}}

 sed -n "/Mean/p" ${{sample}} |\

 sed "s/.*Mean: \(.*\); Std.*/\\1/g" |\

 paste - - - |\

 sed "s/.*/${{name}}\\t&"

 done | sort -k2,2nr > {output[0]}

 head -n 50 {output[0]} | tail -n 40 | cut -f 1 | sed \'s/\([0-9a-zA-Z]*\)_.*/&\t\1/\' > {output[1]}

 """


rule de_novo_cstacks:

 input:

 "info/popmap.catalog.tsv",

 expand("03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.snps.tsv.gz", sample=SAMPLES)

 params:

 stacks_path = "03-stacks-analysis/de-novo/",

 mismatch = MISMATCH

 threads: 10

 log:"03-stacks-analysis/de-novo/de_novo_cstacks.oe"

 output:

 "03-stacks-analysis/de-novo/batch_1.catalog.alleles.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/de-novo/batch_1.catalog.snps.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/de-novo/batch_1.catalog.tags.tsv.gz"

 shell:"""

 cstacks -p {threads} -P {params.stacks_path} -M {input[0]} \

 -n {params.mismatch} &> {log}

 """


rule de-novo_sstacks:

 input:

 "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.snps.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.tags.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.models.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.alleles.tsv.gz"

 params:

 catalog = "03-stacks-analysis/de-novo/batch_1",

 sample = lambda wildcards: "03-stacks-analysis/de-novo/"   wildcards.sample

 output:

 "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.matches.tsv.gz"

 log: "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.sstacks.oe"

 shell:"""

 sstacks -c {params.catalog} -s {params.sample} -o 03-stacks-analysis/de-novo &> {log}

 """


# reference-based data analysis

## read alignment with bwa-mem

rule bwa_mem:

 input: "01-clean-data/{sample}.fq.gz"

 params:

 index = INDEX,

 mismatch = "3",

 gap = "5,5"

 threads: 8

 output: "02-read-alignment/ref-based/{sample}.bam"

 shell:"""

 mkdir -p 02-read-alignment

 bwa mem -t {threads} -M -B {params.mismatch} -O {params.gap} {params.index} {input} \

 | samtools view -b > {output}

 """


## find variant loci

rule pstacks:

 input: "02-read-alignment/ref-based/{sample}.bam"

 params:

 outdir = "03-stacks-analysis/ref-based/",

 index = lambda wildcards: INDEX_DICT.get(wildcards.sample)

 threads: 8

 output:

 "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.snps.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.tags.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.models.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.alleles.tsv.gz"

 log: "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.pstacks.oe"

 shell:"""

 mkdir -p 03-stacks-analysis/ref-based

 pstacks -p {threads} -t bam -f {input} -i {params.index} -o {params.outdir} &> {log}

 """


## A catalog can be built from any set of samples processed by the ustacks or pstacks programs

rule ref_based_cstacks:

 input: "info/popmap.tsv",expand("03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.snps.tsv.gz", sample=SAMPLES)

 threads: 10

 output:

 "03-stacks-analysis/ref-based/batch_1.catalog.alleles.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/ref-based/batch_1.catalog.snps.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/ref-based/batch_1.catalog.tags.tsv.gz"

 shell:

 "cstacks -p {threads} --aligned -P 03-stacks-analysis/ref-based/ -M {input[0]}"


## Sets of stacks, i.e. putative loci, constructed by the ustacks or pstacks programs

## can be searched against a catalog produced by cstacks.

rule ref_based_sstacks:

 input:

 "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.snps.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.tags.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.models.tsv.gz",

 "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.alleles.tsv.gz"

 params:

 catalog = "03-stacks-analysis/ref-based/batch_1",

 sample = lambda wildcards: "03-stacks-analysis/ref-based/"   wildcards.sample

 output:

 "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.matches.tsv.gz"

 log: "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.sstacks.oe"

 shell:"""

 sstacks --aligned -c {params.catalog} -s {params.sample} -o 03-stacks-analysis/ref-based &> {log}

 """

将以上代码保存为Snakefile，没有集群服务器，就直接用 snakemake运行吧。因为我能在集群服务器上提交任务，所以用如下代码

snakemake --cluster "qsub -V -cwd" -j 20 --local-cores 10 &

plot_n_snps_per_locus.R的代码

#!/usr/bin/env Rscript


snps_per_loc = read.delim(\'./n_snps_per_locus.tsv\')

# Keep only M==n, m==3

snps_per_loc = subset(snps_per_loc, M==n & m==3)

# Rename column 1

colnames(snps_per_loc)[1] = \'par_set\'


# Create a new data frame to contain the number of loci and polymorphic loci

d = snps_per_loc[,c(\'par_set\', \'M\', \'n\', \'m\')]

d = d[!duplicated(d),]


# Compute these numbers for each parameter set, using the par_set column as an ID

rownames(d) = d$par_set

for(p in rownames(d)) {

 s = subset(snps_per_loc, par_set == p)

 d[p,\'n_loci\'] = sum(s$n_loci)

 s2 = subset(s, n_snps > 0)

 d[p,\'n_loci_poly\'] = sum(s2$n_loci)

}


# Make sure the table is ordered

d = d[order(d$M),]


pdf(\'./n_loci_Mn.pdf\')


# Number of loci

# ==========


plot(NULL,

 xlim=range(d$M),

 ylim=range(c(0, d$n_loci)),

 xlab=\'M==n\',

 ylab=\'Number of loci\',

 main=\'Number of 80%-samples loci as M=n increases\',

 xaxt=\'n\',

 las=2

 )

abline(h=0:20*5000, lty=\'dotted\', col=\'grey50\')

axis(1, at=c(1,3,5,7,9))

legend(\'bottomright\', c(\'All loci\', \'Polymorphic loci\'), lty=c(\'solid\', \'dashed\'))


lines(d$M, d$n_loci)

points(d$M, d$n_loci, cex=0.5)


lines(d$M, d$n_loci_poly, lty=\'dashed\')

points(d$M, d$n_loci_poly, cex=0.5)


# Number of new loci at each step (slope of the previous)

# ==========


# Record the number of new loci at each parameter step

d$new_loci = d$n_loci - c(NA, d$n_loci)[1:nrow(d)]

d$new_loci_poly = d$n_loci_poly - c(NA, d$n_loci_poly)[1:nrow(d)]


# Record the step size

d$step_size = d$M - c(NA, d$M)[1:(nrow(d))]


plot(NULL,

 xlim=range(d$M),

 ylim=range(c(0, d$new_loci, d$new_loci_poly), na.rm=T),

 xlab=\'M==n\',

 ylab=\'Number of new loci / step_size (slope)\',

 main=\'Number of new 80%-samples loci as M=n increases\'

 )

abline(h=0, lty=\'dotted\', col=\'grey50\')

legend(\'topright\', c(\'All loci\', \'Polymorphic loci\'), lty=c(\'solid\', \'dashed\'))


lines(d$M, d$new_loci / d$step_size)

points(d$M, d$new_loci / d$step_size, cex=0.5)


lines(d$M, d$new_loci_poly / d$step_size, lty=\'dashed\')

points(d$M, d$new_loci_poly / d$step_size, cex=0.5)


null=dev.off()

plot_n_loci.R的代码

#!/usr/bin/env Rscript


d = read.delim(\'./n_snps_per_locus.tsv\')

# Keep only M==n, m==3.

d = subset(d, M==n & m==3)

# Make sure the table is ordered by number of snps.

d = d[order(d$n_snps),]


Mn_values = sort(unique(d$M))


# Write the counts in a matrix.

m = matrix(NA, nrow=length(Mn_values), ncol=max(d$n_snps) 1)

for(i in 1:nrow(d)) {

 m[d$M[i],d$n_snps[i] 1] = d$n_loci[i] # [n_snps 1] as column 1 is for loci with 0 SNPs

}


# Truncate the distributions.

max_n_snps = 10

m[,max_n_snps 2] = rowSums(m[,(max_n_snps 2):ncol(m)], na.rm=T)

m = m[,1:(max_n_snps 2)]

m = m / rowSums(m, na.rm=T)


# Draw the barplot.

pdf(\'n_snps_per_locus.pdf\')


clr = rev(heat.colors(length(Mn_values)))


barplot(m,

 beside=T, col=clr, las=1,

 names.arg=c(0:max_n_snps, paste(\'>\', max_n_snps, sep=\'\')),

 xlab=\'Number of SNPs\',

 ylab=\'Percentage of loci\',

 main=\'Distributions of the number of SNPs per locus\nfor a range of M==n values\'

 )

legend(\'topright\', legend=c(\'M==n\', Mn_values), fill=c(NA, clr))


null=dev.off()

第三步：过滤并导出数据

这一步的过滤在stacks1.47是分为两个部分。第一部分是对于从头分析和基于参考基因组都使用rxstacks过滤掉低质量变异，然后重新用cstacks和sstacks处理。第二部分是使用population从群体角度进行过滤。 在stacks2.0时代，rxstacks功能不见了(我推测是作者认为作用不大)，既然他们都不要了，那我也就只用population过滤和导出数据了。

这一步主要淘汰那些生物学上不太合理，统计学上不显著的位点，一共有四个主要参数负责控制，前两个是生物学控制,根据研究主题而定

• (-r):该位点在单个群体的所有个体中的最低比例
• (-p): 该位点至少需要在几个群体中存在
• (—min_maf): 过滤过低频率位点，推荐5～10%
• (—max_obs_het): 过滤过高杂合率位点, 推荐60～70%

# 项目根目录
min_samples=0.80min_maf=0.05max_obs_het=0.70populations -P 03-stacks-analysis/ref-based/ -r $min_samples --min_maf $min_maf \
--max_obs_het $max_obs_het --genepop &> populations.oe
# --genepop表示输出格式，可以选择--vcf等

最后会在03-stacks-analysis/ref-based/生成至少如下几个文件：

• batch_1.sumstats.tsv： 核酸水平上的描述性统计值，如观测值和期望的杂合度 π, and FIS
• batch_1.sumstats_summary.tsv: 每个群体的均值
• batch_1.hapstats.tsv：单倍型水平的统计值，如基因多样性和单倍型多样性
• batch_1.haplotypes.tsv： 单倍型
• batch_1.genepop：指定的输出格式
• batch_1.populations.log：输出日志

至此，上游分析结束，后续就是下游分析。后续更新计划：

• stacks总体流程鸟瞰
• Stacks核心参数深入了解
• RAD-seq和GBS技术比较
• 不同简化基因组protocol的比较
• 学习TASSEL-GBS数据分析流程
• 下游分析探索：这个得慢慢来