运行samtools faidx和pileups
前期请先阅读《序列比对工具的对比》
# 我们现在有bwa.bam和bow.bam两个文件。
# Pileup的输出。wgsim模拟器生成的低质量reads会被samtools忽略。
# 用samtools对fasta文件进行索引。
samtools faidx ~/refs/852/NC.fa
# 用samtools查询fasta文件。
samtools faidx ~/refs/852/NC.fa NC_002549:1-10
# 你可以罗列多个区间。
samtools faidx ~/refs/852/NC.fa NC_002549:1-10 NC_002549:100-110
# 探讨一下有参或者无参的输出。
# 查看帮助文档
samtools mpileup
# 不加参考序列的pileup使用
#* -q最低的mapping质量，默认设置是0
#* -Q最低的碱基质量，默认设置是13
samtools mpileup -Q 0 bwa.bam | more
# 有参考序列的pileup使用
samtools mpileup -f ~/refs/852/NC.fa -Q 0 bwa.bam | more
Pileups以及覆盖度
# 首先安装bcftools来处理变异call（实在不知道怎么翻译合适）出来后的格式。
#* 一般把将SNP找出来并以一定格式存储起来的过程称为SNP calling
cd ~/src
curl -OL http://sourceforge.net/projects/samtools/files/samtools/1.1/bcftools-1.1.tar.bz2
tar jxvf bcftools-1.1.tar.bz2
cd bcftools-1.1
make
ln -s ~/src/bcftools-1.1/bcftools ~/bin
# 留意下bcftools和samtools用法方面的相似性。
bcftools
# 使用Lecture8中的比对脚本。
bash compare.sh
# 每次运行完的平均覆盖度是多少？
# NR是指可能与基因组大小不相等的数目或记录。
# 默认情况下，samtools depth只输出覆盖度不为0的区域。
samtools depth bwa.bam | awk '{ sum += $3 } END { print sum/NR } '
# 如何获知基因组的大小？
# 有很多方法，但没有一个特别好的。
# 表头@SQ包含序列长度。
samtools view -h bwa.bam | head | grep @SQ
# 现在我们知道了染色体的大小了。
samtools depth bwa.bam | awk '{ sum += $3 } END { print sum/18959 } '
# 有参考序列或没参考序列的Pileups使用
# 查看使用方法
samtools mpileup
# 不加参考序列的pileup使用
samtools mpileup -Q 0 bwa.bam | more
# 有参考序列的pileup使用
samtools mpileup -f ~/refs/852/NC.fa -Q 0 bwa.bam | more
# Samtools的文本式的基因组浏览器。
# 按下?获取帮助，q或者ESC来退出。
samtools tview bwa.bam
# 为全基因组生成一个变异call出来后的存储格式文件。
samtools mpileup -Q 0 -f ~/refs/852/NC.fa -uv bwa.bam | more
# 生成基因型，然后call变异。
# Samtools是为人类基因组设计的，似乎对病毒基因组支持的不是很完美。
samtools mpileup -Q 0 -ugf ~/refs/852/NC.fa bwa.bam | bcftools call -vm > snps.vcf
# 欢迎来到你的下一个文件格式。
samtools mpileup -Q 0 -f ~/refs/852/NC.fa -uv bwa.bam | grep -v "##" | cut -f 1,2,3,4,5 | head
升级版的脚本
# 对比两个比对软件的输出。
# 使用方法: bash compare.sh
#在出错的地方停止运行。
set -ue
# 数据文件名。
READ1=r1.fq
READ2=r2.fq
# 参考序列文件。两个比对软件需要分别对它进行索引。
REFS=~/refs/852/NC.fa
# 从基因组中生成模拟reads。
# 编辑错误率并重新运行这个pipeline。
wgsim -N 10000 -e 0.1 $REFS $READ1 $READ2 > mutations.txt
# 将mutations文件转成GFF文件。
cat mutations.txt | awk -F '\t' ' BEGIN { OFS="\t"; print "##gff-version 2" } { print $1, "wgsim", "mutation", $2, $2, ".", "+", ".", "name " $3 "/" $4 }' > mutations.gff
# 我们需要添加一个read组到mapping中。
GROUP='@RG\tID:123\tSM:liver\tLB:library1'
# 运行bwa并创建bwa.sam文件。
bwa mem -R $GROUP $REFS $READ1 $READ2 > bwa.sam
# 运行bowtie2并创建bow.sam文件。
bowtie2 -x $REFS -1 $READ1 -2 $READ2 > bow.sam
# 调整bowtie2
# bowtie2 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50 -x $REFS -1 $READ1 -2 $READ2 > bow.sam
# 对每个sam文件，都转换成bam（sam的二进制）格式。
for name in *.sam;
do
samtools view -Sb $name > tmp.bam
samtools sort -f tmp.bam $name.bam
done
# 删除中间文件。
rm -f tmp.sam tmp.bam
# 修改名字，使得他们不再含有两个后缀。
mv bwa.sam.bam bwa.bam
mv bow.sam.bam bow.bam
# 对数据进行索引。
for name in *.bamdosamtools index $namedone
# 删除这个程序生成的所有文件。
# rm -f *.bam *.bai *fq *.txt *.sam *.gff