碱基平衡性与barcode选择

碱基平衡性

碱基复杂度与碱基多样性是一个意思；复杂度高，碱基即平衡。低多样性(low diversity)即碱基不平衡，指碱基的组成太单纯了，种类少。碱基复杂度本来无关紧要，从前除了设计PCR的时候考虑高GC(GC-rich)以外，基本没人思考这个问题，没人觉得这是一个问题。随着Illumina的二代测序技术风靡全球，独占鳌头，这个不起眼的概念意外地变得重要起来。

一、概念

对于一个基因来说，它所包含的碱基种类越多，则碱基复杂度越高；如果各种碱基的百分含量越接近一致，则碱基组成越平衡。

假设一个DNA片段，它的全部碱基都是A，AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，显然其碱基组成是极度不平衡的。

DNA碱基有4种：AGCT。所以碱基最平衡的情况就是：%A=%G=%C=%T=25%，比如这样的DNA片段：AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCT。

以上是从纵的方面讲的。对于二代测序，更重要的是横的方面。假设12个基因整整齐齐站成一排，第一个位置的12个碱基如果都是A，复杂度太低，严重不平衡；如果A和G各有6个，虽然平衡了，但是复杂度还是不够；如果AGCT各有3个，最复杂，也最平衡；如果A3个G4个C4个，T1个，虽然复杂，但是严重不平衡。

二、影响

4张滤色片，在4个波长处收集信号，然后合成，进行cluster定位及其他运算。如果缺少一种碱基，该波长的照片就是全黑的，没有信号，无法完成图片合并以及cluster定位，导致数据浪费。

需要特别注意碱基复杂度的二代测序应用:PCR产物测序，特别是用于鉴定细菌、真菌以及其他物种的16S rRNAPCR产物测序；小RNA测序；甲基化测序。

三、增加碱基复杂度的方法

文库：

1. 把不同的文库混合在一起。
2. 如果没有其他文库，那么掺入人基因组DNA文库、人外显子组文库或者PhiX标准品。这些都是已知碱基平衡的。

引物：

1. 对于PCR产物来说，只要引物长度不同，就能自然错开，增加碱基复杂度。
2. 采用多对序列不同的引物来完成扩增，然后将产物混合在一起。

Barcodes：

1. 仔细挑选barcode组合，确保每个位置都有3-4种碱基且碱基分布均匀。

##barcode 选择

很多情况下，我们需要把多个样本混合在一起，在同一个通道(lane)里完成测序。像转录组测序、miRNA测序、lncRNA测序、ChIP测序等等，通常每个样本所需要的数据量都比较少，远少于HiSeq一个通道的产出能力，混合样本是非常常见。以转录组测序为例，一个样本测序60 M reads (8G PF data) ，就能够满足绝大部分研究所需。而HiSeq2500-PE125的一条通道，使用V4试剂，数据产出>480 M reads。为了充分利用测序仪产能，节约成本，需要把7~8个RNA样本混合起来。

为了能够把测序数据按样本分离（de-multiplexing），在构建文库(library)的时候，需要用不同的标签序列(index, 也叫barcode)对文库进行标记。只有文库作了记号，数据才能区分。

Barcode的选择是一门技术活。如果barcode组合不佳，标签序列测序质量下降，部分或者全部标签碱基识别不正确，将导致部分数据无法归属到任何一个样本，成为undetermined数据，造成浪费。

一、如何判断barcode组合好坏

1. 碱基平衡。好的barcode组合必须是“4种碱基达到平衡”的，或者说碱基复杂度高。具体就是：
   a. 在一组barcode的每一个位置，同时存在A、G、C、T四种碱基，不缺少任何一种碱基；
   b. 这4种碱基的比例接近，最好各1/4，分别为25%左右，没有任何一种碱基特别多或者特别少。
2. 激光平衡。 受客观条件限制

a.试剂盒提供的barcode种类有限
b.有些barcode已经被其他样本占用，导致可选的余地受限制，这就导致barcode组合经常无法达到理想的碱基平衡要求。退而求其次，要力保“红绿激光达到平衡”。

在所有型号的Illumina测序仪中，A和C两种碱基共用一种激光，由波长660 nm的红激光激发；G和T共用一种激光，由波长532 nm的绿激光激发。对于一组barcode的每一个位置，如果A＋C的总数与G＋T的总数相接近，可以在一定程度上弥补碱基不平衡的负面作用。

3、激光平衡是次优选择，不得已而为之。它虽然可以在一定程度上提高barcode测序质量，减少de-multiplexing出问题的可能性，但是并不是说，只要激光平衡了，测序数据的分离就一定不受影响。
4、如果barcode组合碱基也不平衡，激光也不平衡，则de-multiplexing风险非常高。

二、Barcode组合举例

1. 好的组合。

Illumina推荐的12个样本barcode组合如下。

以第一个位置（纵列）为例，A:G:C:T=3:3:3:3=1:1:1:1。实际上，该barcode组合每个位置的碱基比例都接近1:1，碱基平衡度近乎完美。

1. 不好的组合

下面的组合有缺陷。比如说，第1个位置只有A和C两种碱基，A、C都属于红激光，导致绿激光没有信号，碱基和激光都不平衡。

AGT TCC
ACT GAT
ACG AGC
ACT CCT
CAA AAG
CAA CCA
CAC CAG

三、Barcode碱基不平衡的后果

1. 如果barcode组合的碱基组成不平衡，会导致测序进行到这些碱基时，软件对测序信号的处理出现障碍，不能准确地识别这些碱基(base-calling)，表现为QV值降低，%Q30曲线波动。
2. 在这种情况下，运用生物信息软件对测序数据进行数据分离（de-multiplexing）出现困难，部分数据不能准确分离，成为undetermined 数据的一部分，造成undetermined数据增多，可分离的数据减少。
3. 如果测序数据的总量很多，远大于全部样本数据量期望值的总和，则问题有可能不那么严重，全部或者大部分样本仍然可能分离到足够的数据量。
4. 万一样本性质特殊，反应效率低；或者混合样本之间竞争和抑制严重，导致测序数据总量在期望值附近，余量很少；或者其中个别样本数据量特别少，这时如果undetermined数据比例过高，就会导致部分或者全部样本的数据量不够用。
5. 混合样本补数据是一个非常麻烦的问题，成本极高。如果一组样本中只有个别样本需要补数据，由于文库是混合在一起的，其他样本也不得不跟着重测一次。这是困难之一。困难之二，如果数据缺口比较小，本来可以与其他样本混合，搭个便车，可是，进行第二次混合的时候，经常会遇到barcode冲突或者碱基不平衡，拼lane非常困难，往往要等很长时间，才有合适的机会。

四、实验证明de-multiplexing成功，该barcode组合今后是否一定好用

1. 如果barcode组合碱基平衡，则无论样本怎么变，该组合一定好用。
2. 如果barcode组合的碱基组成不理想，即使以前的实验证明好用，不等于今后一定好用。下一次测序效果可能好，也可能不好。
3. 这是由于不同的项目样本不同，有可能导致两种后果：

a.数据总量在期望值附近，余地不够多，de-multiplexing后部分样本数据量不够；
b.如果新的样本本身也碱基不平衡，read 1测序质量很差，会影响到barcode和read2的测序质量。当然，情况b责任不在barcode，即使barcode很好，数据还是不够。

五、补救措施

如果满足以下两个条件：

a. 混合样本的数据总量足够，只是由于barcode质量不好，导致de-multiplexing后部分或全部样本数据量不够；
b. 排除QV值低的barcode碱基后，其余质量好的barcode碱基仍然足够用来区分全部样本；

那么，可以通过改变de-multiplexing算法来为每个样本获得尽量多的数据。比如去掉信号识别模糊的碱基，或者增加mismatch碱基的数目，重新运行de-multiplexing程序。

六、样本少于4种，不可能碱基平衡，怎么办

如果样本数少于4种，每一个位置的碱基最多只有3种，不可能碱基平衡，怎么办呢？这时一定要保证激光平衡。Illumina推荐了3种low-level pooling的barcode组合：

2个样本：
:—:|:—-:
#6|GCC AAT
#12|CTT GTA

3个样本：
:—-:|:—-:
#4|TGACCA
#6|GCCAAT
#12|CTTGTA

6个样本：
:—:|:—:
#2|CGATGT
#4|TGACCA
#5|ACAGTG
#6|GCCAAT
#7|CAGATC
#12|CTTGTA

这3种组合包含一个共同内核：6号和12号。6号和12号组合是百分百激光平衡的，每一个位置的碱基（纵列，即GC、CT、CT、AG、AT和TA）都分别属于不同的激光。只要barcode组合中包含6号和12号，就能满足最基本的要求，不至于颗粒无收。6号和12号是barcode组合的核心，不可或缺。