bismark 识别甲基化位点

在bismark中，根据甲基化的C所处的上下文环境，分成以下3类；

1. CpG
2. CHG
3. CHH

p代表磷酸二酯键，CpG指的是甲基化的C的下游是1个G碱基。H代表除了G碱基之外的其他碱基，即A, C, T中的任意一种，CHG代表甲基化的C下游的2个碱基是H和G, CHH表示甲基化的C下游的两个碱基都是H。

bismark 比对完之后，会生成1个bam 文件。使用bismark_methylation_extractor命令可以从bam 文件中识别到甲基化的C，命令如下

bismark_methylation_extractor —comprehensive test/test_data_bismark_bt2.bam

只有1个参数，这个bam 文件是bimark比对生成的bam文件，每个样本一个bam文件。

默认情况下，软件会自动根据两个因素生成结果文件

1. 甲基化的C的类型
   就是前面提到的CpG, CHG, CHH 3种类型
2. 比对情况
   包括比对到四条链上OT, OB, CTOT, CTOB 4种情况
   所以会生成 3 X 4 = 12 个文件，对于链特异性文库来说，会生成3 X 2 = 6 个文件，这6个文件内容是类似的，都是记录了甲基化的C的染色体位置。

comprehensive选项的作用就是在生成最终文件时，只考虑3种甲基化类型，将所有的比对情况进行合并，这样最终只会生成3个文件.

CpG_context_test_data_bismark_bt2.txt
CHG_context_test_data_bismark_bt2.txt
CHH_context_test_data_bismark_bt2.txt

以CpG_context_test_data_bismark_bt2.txt为例，内容如下：

Bismark methylation extractor version v0.19.0
SRR15024317_length=86   -       1       57798691        z
SRR15024319_length=86    +       2       10166600        Z
SRR15024331_length=86  +       11      77736289        Z
SRR15024338_length=86  +       3       197272186       Z

共5列，第一列为比对上的序列ID，第二列为基因组的正负链信息，第三列为染色体编号，第四列染色体上的位置，第5列为甲基化的C的状态。

不同字母表示不同的甲基化C:

X 代表CHG中甲基化的C
x  代笔CHG中非甲基化的C
H 代表CHH中甲基化的C
h  代表CHH中非甲基化的C
Z  代表CpG中甲基化的C
z  代表CpG中非甲基化的C
U 代表其他情况的甲基化C(CN或者CHN)
u  代表其他情况的非甲基化C (CN或者CHN)

对于CpG, 采用字母X的大小写来表征甲基化状态；对于CHG, 采用字母H的大小写来表征甲基化状态；对于CHH, 采用字母Z 的大小写来表征甲基化状态。

上面的文件是methylation calling 最直接的证据，但是对于甲基化水平的定量来说，缺少了相关信息。运行bismark_methylation_extractor时，除了生成上述文件之外，还会有下列3个文件

test_data_bismark_bt2_splitting_report.txt
test_data_bismark_bt2.M-bias.txt
test_data_bismark_bt2.M-bias_R1.png

test_data_bismark_bt2_splitting_report.txt

记录了该样本甲基化的汇总信息

Final Cytosine Methylation Report
Total number of C’s analysed:    40348
Total methylated C’s in CpG context:    1365
Total methylated C’s in CHG context:    21
Total methylated C’s in CHH context:    103
Total C to T conversions in CpG context:    678
Total C to T conversions in CHG context:    10076
Total C to T conversions in CHH context:    28105
C methylated in CpG context:    66.8%
C methylated in CHG context:    0.2%
C methylated in CHH context:    0.4%

test_data_bismark_bt2.M-bias.txt

定义了每一个甲基化位点的详细信息，%methylation就是我们定量常用的beta 值
部分文件内容如下

CpG context
position        count methylated        count unmethylated      % methylation   coverage
1       42      13      76.36   55
2       31      9       77.50   40

test_data_bismark_bt2.M-bias_R1.png

双坐标轴图，左侧的纵轴代表甲基化比例，右侧的纵轴代表甲基化的数目，横坐标代表测序读长。