使用高版本SMRT Analysis软件对Pacbio reads进行基因组De novo组装

2017/05/05来源：陈连福的生信博客评论4,313

1. SMRT Analysis简介

SMRT Analysis软件是由Pacbio Science公司开发的软件，现在是SMRT Link软件的一部分，用于对Pacbio Long Reads数据进行分析。其2.3版本仅能用于对Pacbio RSII测序仪获得的h5格式测序数据进行，该版本持续了较长一段时间。后来Pacbio测序仪增添Sequel平台后，SMRT Analysis软件更新到3.0，增加支持对Pacbio Sequel测序仪获得的bam格式数据进行分析。现在（2018.09.02）最新版本的SMRT Analysis到了5.1版本。

2. 下载并安装SMRT Link软件

将SMRT Link安装到CentOS 6.9系统中。安装软件前需要做一些准备：

首先，确定主机名是localhost并指向127.0.0.1的IP地址。刚安装完毕的系统一般都满足此要求。
保证/etc/hosts文件中含有以下一行信息：
127.0.0.1    localhost
 
其次，修改/etc/security/limits.conf文件，尾部增添如下4行：
chenlianfu      soft    nproc   10240
chenlianfu      hard    nproc   102400
chenlianfu      soft    nofile  10240   
chenlianfu      hard    nofile  102400
注意chenlianfu是安装SMRT Analysis软件所使用的用户的用户名。
该步骤用于增加chenlianfu用户的权限，这是与SMRT软件较高的资源消耗和较多的并行化相关的。
此外，注意此步骤过后，从新登陆
 
然后，修改/etc/sysconfig/iptables文件，增加5432（PostGresql数据库需要）、9090和8243（软件网页端使用tomcat提供服务时需要9090和8423）端口。在该文件中正确的位置增加如下两行：
-A INPUT -m state --state NEW -m tcp -p tcp --dport 5432 -j ACCEPT
-A INPUT -m state --state NEW -m tcp -p tcp --dport 9090 -j ACCEPT
-A INPUT -m state --state NEW -m tcp -p tcp --dport 8243 -j ACCEPT
然后重启防火墙，让修改生效：
# /etc/init.d/iptables restart
 
最后，启动PostGresql数据库。
# /etc/init.d/postgresql initdb
# /etc/init.d/postgresql start
# chkconfig postgresql on

从Pacbio Science官网下载SMRT Link软件。

将SMRT Link安装到 ~/biosoft 目录下
$ mkdir ~/biosoft
$ cd ~/biosoft
$ wget https://downloads.pacbcloud.com/public/software/installers/smrtlink_5.1.0.26412.zip
$ unzip smrtlink_5.1.0.26412.zip
    要求输入密码，可以从下载该软件的网页中找到。
$ ./smrtlink_5.1.0.26412.run
    根据提示一步一步进行配置，基本都是直接使用默认值，按Enter键即可。
    设置软件临时文件夹的时候，要选择一个较大分区所对应的目录。我将其设置为/home/chenlianfu/biosoft/tmp/smrtlink
$ /home/chenlianfu/biosoft/smrtlink/admin/bin/services-start
    启动SMRT Link软件。

3. 使用HGAP4进行基因组De novo组装

1. SMRT Link软件必须要在Chrome浏览器中打开。在Chrome浏览器中输入安装有SMRT Link软件机器的IP地址，并接:9090，例如：192.168.30.1:9090，就可以连接到软件的用户登陆界面，输入用户名admin，密码admin则会进入软件。
 
2. 点击Data Management，再点击VIEW OR IMPORT SEQUENCE DATA，点击IMPORT并从下拉菜单中点击Sequel Sequence Data，从弹出的浏览设置中选择路径/home/chenlianfu/biosoft/smrtlink/install/smrtlink-release_5.1.0.26412/bundles/smrtinub/install/smrtinub-release_5.1.0.25847/private/pacbio/canneddata/lambdaTINY/m150404_101626_42267_c100807920800000001823174110291514_s1_p0.subreadset.xml，点击IMPORT，运行一段时间后，导入数据成功。
 
3. 返回到软件主界面，点击SMRT Analysis，点击CREATE NEW ANALYSIS，在Analysis Application下拉菜单中选择Assembly(HGAP 4)，Analysis Name栏随便填写字符串Lambda_HGAP4，在Genome Length栏将基因组大小修改为58000，在Data Sets中勾选lambda/007_tiny，最后点击START，开始程序运行。
 
4. 值得注意的是公司给的测序数据文件夹中常常不包含sts.xml、adapters.fasta和scraps bam等文件，而在总的xml文件中却包含了这些信息，需要将其对应的行（第7行到第15行）删除掉后再运行HGAP4，否则程序运行会失败。
 
5. 程序运行结果在/home/chenlianfu/biosoft/smrtlink/userdata/jobs_root/目录下的一个数字编号（按运行顺序从000001开始编号）的文件夹中。该文件夹中的的主要结果文件（也可以在网页中下载）：
./tasks/pbcoretools.tasks.contigset2fasta-0/file.fasta 最终的基因组组装结果。
./tasks/pbcoretools.tasks.gather_fasta-1/file.fasta 按某个长度