如何挑选宏基因组样本

在做完16S、18S或ITS等微生物多样性研究后，我们常常还会想进一步了解微生物群落的功能。通常情况下，会采用宏基因组、宏转录组或宏代谢组等方法深入分析，但相对于扩增子测序，宏基因组等测序手段的价格还是相对较高，因此需要从已测完的样本中再挑选合适的样本进行宏基因组测序。那么，这个时候就遇到一个问题——我们该如何挑选样本呢？

图1.16s+宏基因组关联分析思路

1.What——什么是microPITA

在人类微生物组项目（HMP）中，有5516个16s的样本，但其中只有682个样本进行了宏基因组测序，后续样本随机选择[1]；在Yatsunenko等人的研究中，从532个16s样本中挑选110个样本进行宏基因组测序，没有明确的选择标准[2]。

而样本选择的方法，最好还是需要有一个可参考并且能提供给后人进行验证的方法，因此，microPITA软件应运而生[3]。microPITA(Microbiomes: Picking Interesting Taxa for Analysis)，是由麻省理工学院的Tickle 等人研发，并且可以免费使用。

当我们的研究目标不同时，感兴趣的微生物群落特征也就随之发生改变。因此microPITA提供了4种无监督的方法和2种有监督的方法帮助大家进行样本挑选。

以HMP的16s肠道样本为例（图2），用不同的方法进行选择时，结果也会不同。分别使用目标物种为拟杆菌(蓝色)、最大多样性(橙色、代表性差异(紫色)和最不相似(粉红色)这四种方法筛选出10个样本。

可以看出，目标特征为拟杆菌为主的样本大多集中在PCOA中左上的位置；最大多样性则会选择更多样化的样本；代表性差异的方法会涵盖PCOA范围中大部分的样本，集中在密度较高的中心区域；而最不相似方法选择出的样本会在PCOA的外围。由此可见，当我们选择的方法不一样时，筛选出的样本也会随之发生改变。

图2.不同方法挑选的样本

2.How——microPITA如何保证结果的稳定性

当我们做了16s测序后，从中挑选出的样本需要保持与之前的特征一致，或者说更具有我们关注的特征。但有的时候，我们可能不太确定应该选择多少个样本用于后续的研究，并且选择出来的样品是否稳定，是否还依然保持着和16s结果一样的特征，如果是随机挑选的话，我们无法回答这些问题。

而microPITA能帮助我们解决这些问题。当采用不同的方法进行连续选择样品时（图3），目标特征为拟杆菌和最大多样性的方法，都是从PCOA的一端蔓延到另一端，代表性差异的方法会从整个PCOA范围内进行选择，最不相似方法则是由PCOA的外围到核心。

无论是哪种方法，在连续挑选时都具有非常明显的变化趋势，说明在选择的过程中，microPITA是有规可循，而不是随机选择，并具有一定的稳定性。microPITA的稳定性可以帮助我们在连续不断的选择过程中，找到最适合的样本数目。

图3. 不同方法挑选连续的样本

除此之外，我们还需要确认选择后的样本是否保持着原先样本的特性，这一点，可以通过选择样本前后特性的柱状图进行比较。当我们选择生态多样性最丰富的样本进行分析时，选择出的样本仍然保持着多样性（图4a）；采用feature的方法时，关心的特征物种的丰度会明显高于之前的样本（图4b）。

当使用有监督的方法时，挑选后结果的差异也很明显，选择Discriminative即分组中心最近的方法时，会挑选具有组间区分度的“同类”的样本（图4c），而选择Distinct即组间β多样性距离最大的方法时，会挑选具有组间区分度“极端”的样本（图4d）。可以看出，不管是哪种方法，最终选出的样本保持着原先的特性，并且更加符合我们的预期。

图4.挑选后的结果，selceted代表利用不同方法所挑选的目标样本，not selected表示所有样本。a,b,c,d图分别是利用不同的挑选方法进行挑选。

3.Application——microPITA如何应用

最后，我们可以来看一篇文章案例，看看高分文章是如何利用microPITA软件进行样本选择[4]。

图5.多组学研究肠道微生物与自身免疫的形成机制

根据卫生假说，在婴儿期早期暴露于特定微生物和寄生虫有利于免疫系统发育，并对过敏性疾病和自身免疫性疾病提供保护。因此作者跟踪了北欧的222名婴儿，观察从出生到三岁的发育情况，发现芬兰和爱沙尼亚（高过敏症人群）的婴儿普遍患有早期自身免疫性疾病，但在俄罗斯（低过敏症人群）相对较少。

因此对这三个国家的婴儿肠道微生物进行了研究，挑选了1548个样本进行16s测序，研究物种组成、多样性和差异分析，接着利用microPITA挑选出785个用于后续研究的样本，进行物种组成和功能分析。

作者通过16s测序发现，芬兰和爱沙尼亚婴儿的肠道中存在大量拟杆菌门的细菌，而俄罗斯婴儿的肠道则为大肠杆菌，表明拟杆菌很有可能驱动人群的自身免疫差异；通过PCA分析，结果显示芬兰和爱沙尼亚人的群落结构更为接近，表示芬兰和爱沙尼亚的自身免疫效果类似（图6）。

图6.16s结果，物种组成（左）和PCA结果（右）

通过microPITA挑选样本后进行宏基因组测序，结果发现芬兰、爱沙尼亚与俄罗斯人群LPS（脂多糖）的合成存在差异，芬兰和爱沙尼亚肠道LPS的合成主要来源于拟杆菌，而俄罗斯则相反，这表示拟杆菌有可能通过LPS合成参与人群的自身免疫调节。

图7.宏基因组结果，不同人群肠道微生物LPS合成模式（左）和贡献物种（右）都存在差异

接着作者针对两种不同菌产生的LPS进行了分子结构、免疫刺激性属性等后续实验，表明拟杆菌LPS在结构上与大肠杆菌的LPS不同,并抑制先天免疫信号和内毒素耐受性，并且发现拟杆菌LPS不能降低非肥胖糖尿病小鼠自身免疫性糖尿病的发病率。从而得出最终结论，在对自身免疫敏感性高的国家的儿童菌群中，拟杆菌产生一种具有免疫抑制特性的脂多糖(LPS)，其特性可能会妨碍早期免疫训练并导致I型糖尿病的发生。

这是一篇非常典型的16s+宏基因组关联的案例，文章先进行了16s测序，从中发现了肠道微生物存在物种上的差异（16s侧重于物种组成），接着进一步挑选出样本进行宏基因组测序，对肠道微生物的功能进行研究（宏基因组侧重于功能研究），最后加上功能试验，得出了最终的结论。

想要尝试这两个组学关联分析的老师同学们，microPITA是个非常好的帮手。如果想要进行分析的话，请联系我们哦~基迪奥会为您量身定制专业的个性化实验分析方案。

参考文献：

1.Gevers D, Knight R, Petrosino JF, Huang K,McGuire AL,Birren BW et al. (2012). The human microbiome project: a communityresource for the healthy human microbiome. PLoS Biol 10: e1001377.

2.Yatsunenko T, Rey FE, Manary MJ, Trehan I, DominguezBelloMG, Contreras M et al. (2012). Human gut microbiome viewed across age andgeography. Nature 486: 222–227.

3.Tickle T L, Segata N, Waldron L, et al. Two-stagemicrobial community experimental design[J]. The ISME journal, 2013, 7(12):2330.

4.VatanenT, Kostic A D, d’Hennezel E, et al. Variation in microbiome LPS immunogenicitycontributes to autoimmunity in humans[J]. Cell, 2016, 165(4): 842-853.