RPKM, FPKM, TPM区别

在RNA-Seq的分析中，对基因或转录本的read counts数目进行標准化（normalization）是一个极其重要的步骤，因为落在一个基因区域內的read counts数目取决於基因长度和测序深度。很容易理解，一个基因越长，测序深度越高，落在其內部的read counts数目就会相对越多。当我们进行基因差异表达的分析时，往往是在多个样本中比较不同基因的表达量，如果不进行数据標准化，比较结果是没有意义的。因此，我们需要標准化的两个关键因素就是基因长度和测序深度，常常用RPKM (Reads Per Kilobase Million), FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 和 TPM (Transcripts Per Million)作为標准化数值。那么，这三者计算原理是什么，有何区別呢？

为了更清楚的展示计算过程，我们用三个样本的4个基因的read counts矩阵做例子（来源於YouTube）。如表1：

大家可以清楚地看到，样本3的4个基因read counts数目明显多於其他两个样本，説明其测序深度较高，基因B的长度的基因A的两倍，也使得其read counts在三个样本中都高於A。接下来我们要做就是对这个矩阵进行標准化，分別计算RPKM, FPKM和TPM,    请睁大你的眼睛（为了使数值可读性更好，下面的计算中我们用10代表million）。

我们先来説説RPKM怎么算。第一步先將测序深度標准化，计算方法很简单，先分別计算出每个样本的总reads数（这里以10为单位），然后將表中数据分別除以总reads数即可，这样就得到了reads per million. 如下表2：

第二步即是基因长度的標准化了。將表2的read per million直接除以基因长度即可，如表3：

到这里，我们即得到了传説中的RPKM。

FPKM和RPKM的定义是相同的，唯一的区別是FPKM適用於双端测序文库，而RPKM適用於单端测序文库。FPKM会將配对比对到一个片段（fragment）上的两个reads计算一次，接下来的计算过程跟RPKM一样。

下面，终於轮到TPM登场了。虽然同样是標准化测序深度和基因长度，TPM的不同在於它的处理顺序是不同的。即先考虑基因长度，再是测序深度。我们仍以表1的那个例子来説明TPM是计算过程。

第一步直接除以基因长度，得到reads per kilobase，如表4：

第二步標准化测序深度时，总的reads数要用第一步中除过基因长度的数值。即第一样本除以15，第二个样本除以20.25，第三个样本除以45.1 （別忘了我们的单位是10哦）。表5就是你们想要的TPM了。

下面，是考验你们数学功底的时候了，有没有看出来TPM分分钟完虐FPKM/RPKM？其实，只要我们在表3和表5下面多加一行你就能很轻鬆地看到区別了。

RPKM

TPM

我们看到每个样本的TPM的总和是相同的，这就意味着TPM数值能体现出比对上某个基因的reads的比例，使得该数值可以直接进行样本间的比较。

看到这里，相信大家已经完全理解了RNA-Seq数据標准化的流程了。虽然现在有很多计算差异表达的软件是直接支持read counts作为输入，並且自已完成標准化过程，如DESeq2，但作为生信人，知道这些中间量的计算过程还是很有必要的。