摘要：
重亚硫酸盐DNA转化是甲基化研究中最常用的技术，因为它相对较简单，而其他方法都很繁琐，需要大量的优化工作。重亚硫酸盐转化方法将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，从而精确分析目标区域内的甲基化。本文介绍的三个流程为甲基化分析提供了有效的方法，步骤也很简单。
DNA甲基化参与许多细胞进程的调节，包括X染色体失活、染色体稳定性、染色质结构、胚胎发育和转录。在哺乳动物中，只有与鸟嘌呤相邻的胞嘧啶（CpG二核苷酸：胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤）的5’碳才是DNA甲基化的底物。
CpG岛的重要性
CpG岛是一段300-3000 bp的DNA区域，富含GC，常出现在启动子的未甲基化区域。CpG岛的甲基化图谱可说明某些基因比其他基因的甲基化频率更高(1)。因此，CpG岛在调节基因表达上扮演着关键的角色。在启动子区域以外发现的CpG岛通常是甲基化的，据认为与重复序列和寄生序列元件如病毒RNA的转录沉默有关。异常的甲基化会导致关键基因的沉默，或者导致与多种疾病包括癌症相关的有害因子的基因表达增加(2)。这种现象让CpG岛的探索和其甲基化状态的鉴别成为当今医学研究的热点(3)。
探索CpG岛的三种流程
重亚硫酸盐DNA转化是甲基化研究中最常用的技术，因为它相对较简单，而其他方法都很繁琐，需要大量的优化工作。重亚硫酸盐转化方法将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，从而精确分析目标区域内的甲基化。本文介绍的三个流程为甲基化分析提供了有效的方法，步骤也很简单。
1. 重亚硫酸盐特异的甲基化敏感的迁移率改变分析（图2）
2. 重亚硫酸盐特异的PCR测序（图4）
3. 重亚硫酸盐特异的克隆测序（图6）
图1. 决策树勾勒出选择应用的过程。在选择一个甲基化流程时，首先需要清楚地了解研究目的，然后再决定哪种技术策略最合适。
三种流程的基本步骤如下：
第1步：DNA提取
利用RecoverAll™总核酸分离试剂盒从经福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织中制备高质量的基因组模板，用MELT™总核酸抽提系统、NuPrep®试剂从组织，或用BloodPrep® DNA试剂从培养的细胞和血液中制备高质量的基因组模板。
提示：由于gDNA的纯度是整个重亚硫酸盐DNA转化实验成功的关键，因此推荐在重亚硫酸盐转化之前增加蛋白酶K消化步骤以除去所有的蛋白质。
第2步：重亚硫酸盐处理
利用MethylSEQr™重亚硫酸盐转化试剂盒转化未甲基化的胞嘧啶，从而将其与甲基化的胞嘧啶区分开来。
第3步：引物设计和扩增
利用Methyl Primer Express软件设计引物。软件可在www.appliedbiosystems.com/methylprimerexpress 上下载。利用AmpliTaq Gold® DNA聚合酶和美国应用生物系统公司的热循环PCR仪扩增目标。
提示：短的扩增子效果更好（150-250 bp用于测序，450 bp用于克隆）。避免在一段区域中出现8-9个以上的T或A，以免引物滑链。同时，利用M13引物进行PCR，因此也可以用同样的引物来测序。
第4步：循环测序和纯化
对于测序特异的流程，利用BigDye Terminator 测序试剂盒进行特定靶点的循环测序。之后需要利用一个可靠的纯化试剂盒去除未掺入的染料终止子和未用到的引物。
提示：为了实现快速、可靠的测序纯化，可利用BigDye® XTerminator™试剂盒进行测序反应的纯化。
第5步：数据收集和分析
应用美国应用生物系统公司的毛细管电泳仪进行分析和数据收集。对获得的数据进行应用特定的分析，阐释结果，从而评估或确定甲基化状态的变化。对于片断分析流程的二次分析，可利用GeneMapper®软件4.0版或Peak Scanner™软件（图2）。对于测序流程的二次分析，可利用Variant Reporter™软件1.0版或SeqScape®软件2.6版（图4、6）。
图2. 重亚硫酸盐特异的甲基化敏感迁移率改变分析流程。
流程1：重亚硫酸盐特异的甲基化敏感迁移率改变分析（MSMSA）
MSMSA是一种DNA片断分析应用，用于评估特定扩增子的甲基化程度。图2中的前三个步骤与上面描述的基本流程相似。片断分析中的样品也可用于下游的测序步骤，让这种应用成为筛选的理想之选。分析引物的设计类似于重亚硫酸盐测序引物（如针对没有CpG岛的区域设计），可借助于Methyl Primer Express软件，因此PCR扩增也与甲基化状态无关。正向引物上有一个荧光染料标记（FAM™）。毛细管电泳步骤利用C/T之间的迁移率差异。因此，甲基化的富含C的片断比未甲基化的富含T的片断迁移得更快（图3）。GeneScan™ 600 LIZ® Size Standard可作为分析片段大小的标准。对于数据分析，可用GeneMapper 软件4.0版或Peak Scanner 软件1.0版。
图3. 扩增子中CpG岛甲基化状态的累积预测。甲基化片断（A组）比未甲基化的片断（C组）迁移得更快。
流程2：重亚硫酸盐特异的PCR测序
此项应用可用于鉴定对生物学过程重要的CpG二核苷酸。图4流程中的前3个步骤已经在上述基本流程中描述过。对多个片断进行直接的PCR测序能对CpG二核苷酸的变化提供定量的结果和信息。图5提供了整个扩增子区域每个CpG位点的定性信息。对于数据分析，可用Variant Reporter软件1.0版或SeqScape 软件2.6版。
图4. 重亚硫酸盐特异的PCR测序。
图5. 整个扩增子区域每个CpG位点的定性信息。对于每个特定的CpG二核苷酸，测序结果将是混合的、未甲基化或甲基化的。
流程3：重亚硫酸盐特异的克隆测序
在这个应用中，多个片断通过克隆而分离，产生定量的结果。图6中的前3个步骤已经在上述基本流程中描述过。接着进行测序和单个样品/克隆的分离。通过分析可确定候选区域特定CpG二核苷酸中的甲基化比例。图7提供了定量的结果，来了解混合样品中每个CpG二核苷酸的甲基化比例。对于数据分析，可用Variant Reporter软件1.0版或SeqScape 软件2.6版。
图6. 重亚硫酸盐特异的克隆测序。
图7. 在混合样品中研究CpG二核苷酸的甲基化比例的定量结果。对于特定的CpG二核苷酸，样品的分析结果将是甲基化或未甲基化。
完整的方案
这三种甲基化图谱分析流程融合了美国应用生物系统公司的试剂盒、试剂、仪器及软件，提供了从DNA提取到数据分析的完整解决方案。用户可利用这些流程实现累积、定性和定量的分析。