使用eggNOG数据库进行基因功能注释

1. 对更全面的物种和更大量蛋白序列进行分类。相比于COG数据库纯人工且较为准确的分类，eggNOG数据库扩大物种和序列数据量，采用了非监督聚类方法进行计算。
2. 对每个同源基因类进行了系统发育树构建、HMM模型构建、GO注释、KEGG Pathway注释、SMART/FPAM结构域注释、CAZyme注释等。
3. 提供了本地化软件和网页工具进行eggNOG注释。

0. e5.proteomes.faa文件：收集所有物种的全基因组蛋白序列文件。一个总的数据库文件。
 
1. members文件：记录OG编号及对应的蛋白序列登录号。编写程序可以从0号文件中提取目标类的蛋白序列数据。
2. annotations文件：记录OG编号的描述信息及所属大类信息。
3. hmms文件：已经构建好的hmm数据库文件。
 
4. raw_algs文件：多序列比对文件
5. trimmed_algs文件：截短后的多序列比对文件
6. tress文件：统发育树文件。
7. stats文件：统计同源基因类的个数。

（1）注释的数据量过大，比如宏基因组数据；
（2）使用更准确的HMMER算法一次性注释超过5000条序列；
（3）想更快地进行eggNOG注释；
（4）网络条件较差。

$ wget https://github.com/eggnogdb/eggnog-mapper/archive/1.0.3.tar.gz -O ~/software/eggnog-mapper-1.0.3.tar.gz
$ tar zxf ~/software/eggnog-mapper-1.0.3.tar.gz -C /opt/biosoft/
$ cd /opt/biosoft/eggnog-mapper-1.0.3
$ python setup.py install
$ echo 'PATH=$PATH:/opt/biosoft/eggnog-mapper-1.0.3' >> ~/.bashrc
$ source ~/.bashrc
$ download_eggnog_data.py euk bact arch viruses
    下载eggNOG v4.5版本的数据库文件eggnog.db和eggnog_proteins.dmnd，并额外下载指定的HMM数据库。可以根据需要选择指定的数据库即可，下载多个数据库消耗更大的磁盘空间：比如euk消耗76G磁盘空间、bact消耗26G磁盘空间、arch消耗7G磁盘空间、viruses消耗468M磁盘空间。

eggnog_proteins.dmnd    所有蛋白序列的DIMOND数据库，用于DIMOND快速序列比对
eggnog.db    功能注释数据库，用于根据比对结果进行功能注释
hmmdb_levels/    存放有各个物种类别的HMM数据库
OG_fasta/    存放各个物种类别的蛋白序列数据库。

使用eggnog-mapper软件，推荐使用软件自带的HMMER和DIAMOND程序。我使用最新版本的HMMER软件，出现错误提示：“truct.error: unpack requires a string argument of length ”并得不到结果。
$ export PATH=/opt/biosoft/eggnog-mapper-1.0.3/bin/:$PATH
 
由于eggNOG数据库较大，推荐将数据库放到内存中，以加快程序运行速度。需要注意的是euk数据比较大，比较费内存，占用了约100G内存左右。
$ emapper.py -d euk -i proteins.fasta -o eggNOG_hmmer --cpu 80 --usemem --no_file_comments
 
若有多组数据需要进行eggNOG注释，可以分两步运行。先将数据库放到内存中，再分别对多组数据进行运算，这样只读取一次数据库到内存中节约运算时间。
$ emapper.py -d euk --cpu 80 --servermode
待数据库加载完毕后，可以在其它终端中执行数据分析。
$ emapper.py -d euk:localhost:51400 -i proteins1.fasta -o eggNOG1 --no_file_comments
$ emapper.py -d euk:localhost:51400 -i proteins2.fasta -o eggNOG2 --no_file_comments

$ python emapper.py -m diamond -i proteins.fasta -o eggNOG_diamond --cpu 80 --no_file_comments
 
分两步运行DIAMOND比对和功能注释。自己手动运行DIAMOND，设置一些性能参数和严格阈值能更有效率。
$ diamond blastp --db /opt/biosoft/eggnog-mapper-1.0.3/data/eggnog_proteins --query proteins.fasta --out eggNOG.tab --outfmt 6 --sensitive --max-target-seqs 20 --evalue 1e-5 --id 30 --block-size 20.0 --tmpdir /dev/shm --index-chunks 1
$ parsing_blast_result.pl -type tab --max-hit-num 1 --db-query proteins.fasta --db-subject /opt/biosoft/eggnog-mapper-1.0.3/eggNOG_Database_5.0/eggnog_proteins.fasta --HSP-num 1 eggNOG.tab | cut -f 1,2,11,12 > eggNOG.emapper.seed_orthologs
$ perl -e '<>; while (<>) { print; }' eggNOG.emapper.seed_orthologs > aa; mv aa eggNOG.emapper.seed_orthologs
$ emapper.py --annotate_hits_table eggNOG.emapper.seed_orthologs -o eggNOG

输入参数：
-h | --help
    打印帮助信息。
-d | --database <string>
    输入使用的数据库名称。一般选择euk，bact，arch。或输入本地计算机上的HMM数据库路径。
-i <string>
    输入query序列FASTA文件。
--translate
    添加该参数，认为输入的FASTA文件是核酸序列，程序能将核酸序列转换为氨基酸序列后用于比对和注释。
--annotate_hits_table <string>
    输入seed ortholog比对信息。该文件分四列：queryID、subjectID、evalue和bit score。输入该信息，则不需要使用-i参数输入fasta文件了，程序直接运行最后一步功能注释。
--data_dir <string>
    输入eggNOG数据库文件所在的路径。
 
输出参数：
--output_dir <string>    default: ./
    设置输出文件夹。
-o | --out <string>
    设置输出文件前缀。
--resume
    添加该参数来继续运行程序。
--override
    添加该参数覆盖已有的结果文件。
--no_search
    不进行HMM比对，使用已有的HMM比对结果。默认情况下，程序使用HMMER算法运行分三步：HMM比对、找seed ortholog和功能注释。
--no_refine
    不利用HMM的比对结果进行序列比对寻找seed ortholog，而结束程序，仅仅报告HMM比对结果。
--no_annot
    不进行功能注释，仅报告HMM和seed ortholog的比对结果。
--temp_dir <string>    default: ./
    设置临时文件夹路径。
--no_file_comments
    添加该参数，在输出结果中不输出注释行信息。推荐添加该参数，程序有BUG容易导致seed_ortholog文件中含有#的注释行出现在结果中部，导致程序运行失败。
--keep_mapping_files
    添加该参数，不删除中间文件中的HMMER或DIAMOND比对结果文件。
--report_orthologs
    将用于功能注释的ortholog信息输出到一个单独的文件中。
 
比对参数：
-m <string>    default: hmmer
    设置比对算法。可以选择的值为hmmer和diamond。
--hmm_maxhits <int>    default: 1
    设置HMMER算法得到的hit结果数量。
--hmm_evalue <float>    default: 0.001
    设置HMMER算法的evalue阈值。
--hmm_score <int>    default: 20
    设置HMMER算法的score阈值。
--hmm_maxseqlen <int>    default: 5000
    忽略长度超过此阈值的query序列。
--hmm_qcov <float>    default: disabled
    设置HMMER算法中query序列的最小覆盖率阈值。
--dmnd_db <string>
    当使用DIAMOND算法时，设置DIAMOND数据库路径。
--matrix <string>    default: BLOSUM62
    设置DIAMOND算法的计分举证。
--gapopen <int>
    设置DIAMOND算法中打开Gap罚分值。
--gapextend <int>
    设置DIAMOND算法中延长Gap罚分值。
--seed_ortholog_evalue <float>    default: 0.001
    进行seed ortholog鉴定时，设定的evalue阈值。
--seed_ortholog_score <int>    default: 60
    进行seed ortholog鉴定时，设定的score阈值。 
 
功能注释参数：
--tax_scope <string>
    仅使用指定物种类下的同源基因进行功能注释。默认设置下是分别对每条query序列进行自动调节。
--target_orthologs <string>
    进行功能注释时，设置选择什么类型的同源基因进行功能注释。可以选择的值有：one2one,many2one,one2many,many2many,all。
--go_evidence <string>
    设置使用什么类型的GO terms进行功能注释。可以设置的值有：experimental，仅使用源自实验证据支持的GO terms；non-electronic，仅使用非电子计算归纳的Go terms。
 
性能参数：
--cpu <int>
    设置程序使用的CPU线程数。
--usemem
    添加该参数，能将HMM数据库读取到内存中，增加计算性能。在程序运行结束后，释放内存。
--servermode
    添加该参数，会自动添加--usemem参数，将HMM数据库读取到内存中，并一直将HMM数据库维持到内存中，并提供数据库服务，直到强行结束程序。