单细胞测序扫盲

一、什么是单细胞测序？

如果简单地说，单细胞测序就是获取单个细胞遗传信息的测序技术，似乎没有多大的帮助。为了理解这个问题，咱们不妨先来了解一下测序技术到底可以做些什么。

目前，测序可以回答以下6类问题：

1. DNA的序列：ATCG怎么排列，以及各序列的丰度；

2. DNA的表观遗传修饰：比如甲基化、羟甲基化，以及组蛋白的各种修饰；

3. RNA的序列：AUCG怎么排列，以及各序列的丰度；

4. RNA的表观遗传修饰：比如近年很火的m6A修饰；

5. 染色质的结构：3C、4C、5C等各种C；

6. 其他魔性应用：比如DNA损伤位置、蛋白-蛋白相互作用等。

单细胞测序，就是想办法在单细胞层面去回答以上6类问题。

二、为什么要使用单细胞测序？

如果把这个问题换个姿势来问，那就变成，为什么非用单细胞测序不可？

世界上没有两片相同的叶子。对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间是有差异的。当然了，这个差异可大可小。

比如说，受精卵从一个细胞开始分裂，并逐渐形成囊胚，最终发育成个体的时候，细胞与细胞之间的差异会越来越大：有的分化成神经元，有的分化成骨骼肌，各自表达着不同的遗传信息，承担着不同的生理功能。

又比如在肿瘤组织中，肿块中心的细胞，肿块周围的细胞，淋巴转移灶的细胞，以及远端转移的细胞，其基因组和转录组等遗传信息，是存在差异的。而这种差异，在临床上，可以决定该肿瘤对某种疗法是否有效。

这就是所谓的遗传信息的异质性。

传统的研究方法，是在多细胞水平进行的。因此，最终得到的信号值，其实是多个细胞的平均，丢失了异质性的信息。为了让大家能够更加直观地理解这个问题，我们不妨来看下面这张图：

为了检测某个蛋白质的表达量，我们可以用Western blot和流式细胞术来实现。但是，用Western blot的话，我们并没有办法区分上述的情况：目的蛋白只在10%的细胞中强表达，还是在50%的细胞里中等表达，还是在所有细胞中弱表达呢？因为最终电泳跑出来，就是一条差不多强度的带。但如果用流式细胞术这种在单细胞水平对荧光强度加以测定的技术，就能区分上述的情况了。

同样道理，单细胞测序能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息。而这将带领整个遗传学领域进入新的次元。

三、如何实现单细胞测序？

目前主要有两种策略来实现单细胞测序。

第一种，也就是目前大多数人所想象的那样，将单个细胞分离出来，并独立构建测序文库，最终进行测序的路线。我们可以通过流式细胞术（含微流体芯片），或者激光捕获显微切割（LCM）来实现。流式细胞术估计大家比较熟悉，就不多讲了，它主要运用于细胞样品。对于组织切片样品来说，主要是通过LCM来获取单细胞，原理可以见下面的示意图。

不过，将单细胞挨个分离出来再分别建库测序，通量非常低，这主要受成本的限制。随着待测单细胞的个数的增长，测序的成本也会几乎呈线性提升。通常做十几二十来个细胞，就要烧掉很多钱了。然而，这数十个细胞，就足够说明问题了吗？

为了克服这个困难，近年来多采取第二种策略：基于标签（barcode）的单细胞识别。它的主要思想是，给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。这种策略，可以通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息。

不过，针对具体的测序类型，给细胞加barcode的方案是有不小的区别的。对于RNA（转录组mRNA）来说，会比较容易理解一些。由于mRNA测序前需要做逆转录，那么我们只需要在poly T引物的5’端加入barcode即可。具体可见下面的示意图（来自文献doi:10.1038/nprot.2016.154）：

首先将单细胞悬液样品和带有barcode的水凝胶珠子，通过微流体芯片，包裹在一个油滴之中。在油滴中进行逆转录之后，每一个单细胞的cDNA文库，就带上了独一无二的barcode了（蓝色部分）。最后，我们再将所有的单细胞cDNA文库混在一起测序，再通过程序识别barcode，区分单细胞。

如果测序对象是DNA，比如全基因组，就需要用别的方式来加barcode。目前主要是通过一种经过改造的高效转座酶（transposase）Tn5来实现。

基因转座是指转座子DNA从一个染色体座位“跳跃”到另外一个座位的过程。在这个过程中，有转座酶的参与。单细胞的DNA测序就利用了这个特性，将barcode DNA预先和转座酶Tn5组装好，再通过上述的微流体技术，将细胞和转座复合物包裹在一个油滴之中。随后，转座酶会把barcode插入到基因组DNA之中。这个过程在文献中也被成为tagmentation。

不过，基于Tn5的barcode复杂度（即能有多少独一无二的barcode）还是比较有限的。为了保证tagmentation的效率，上图中红色的barcode区域不可以过长。同时，为了避免测序错误带来的误识别（如偶尔测错了一个碱基，但却被当成另外一个barcode），barcode的复杂度也不是4的n次方那么高，需要引入校正机制。具体就不展开讲了。总地来说，仅靠Tn5来做单细胞，一次往往仅能识别数十到数百个单细胞。

为了提高复杂度，即一次能够捕获的单细胞数目，目前的解决方案是走组合索引（combinatorial indexing）路线。（见下图，来自文献doi:10.1038/nmeth.4154）

它的主要思路是，通过两步反应，加两次标签。首先，将单细胞悬液放在多孔板中，并用转座酶Tn5给细胞加第一个barcode，这里每个孔中的barcode是不同的。然后，再将样品混合起来，通过流式细胞术，将少量的细胞分选到含有建库PCR引物的多孔板中。而这些引物是带有第二轮barcode的。因此，经过Tn5的转座，和PCR加标签，绝大部分的细胞就能带上独一无二的barcode了。

读到这里，肯定有人发现这个方案存在的问题。举个例子，万一在流式分选时，在第一个孔里分了两个或以上橙色细胞，然后又通过PCR被加上了红色的标签，那这两个单细胞就无法被区分开来了。

确实如此，combinatorial indexing大概会有10%的撞车率（collision rate），即约有10%的机会把两个单细胞被误认为是同一个。这个数值的高低，取决于第一步tagmentation的复杂度（复杂度越高，撞车率越低），以及在分选时，分到每一个孔里的细胞数量（数量越低，撞车率越低）。但是，combinatorial indexing却能一次识别数千个单细胞，将通量提升数十至上百倍。鱼与熊掌，就看实验者的取舍了。