1 低质量细胞的影响
- 细胞破坏后，可能会导致线粒体或核RNAs占比升高（就是上面解释的大量细胞质中mRNA流失，而线粒体或核RNAs含量基本不变），很有可能会根据这个结果形成自己的一个个cluster
- 低质量的细胞一般文库比较小，而差异分析之前一般对文库大小进行一个归一化。比如正常细胞文库大小是100，某个基因表达量是2；损伤细胞的文库大小是10，这个基因表达量还是2。归一化后，损伤细胞中的这个基因表达量计算结果明显会高于正常细胞，呈现一种“本来不优秀，但班里人少了，排名就上升”的状态
- 细胞损伤可能会伴随RNA的流失，因此许多基因可能会被认为“下调”，尤其体现在细胞质核糖体RNA（另外还包括一些细胞质转录本）
- 影响方差估计和PCA结果。真实情况下，可能一个基因在两个细胞中差异并不显著，但是由于其中一个细胞质量低，导致基因表达量在这两个细胞中差异明显；反映在PCA结果就是：前几个主成分会抓取细胞质量的差异，因为这种差异体现得更明显，而将真正的生物学因素放到了后面几个主成分中，因此得到的PCA结果其实也只是反映了细胞质量的差异，而非真正的生物学差异
2 需要注意的点
- 如果一个细胞群体异质性较高，那么很有可能一些高质量细胞本身表达的数量就是比其他细胞少，但事实上它不是技术误差造成的。因此不能通过一个固定的阈值进行过滤，而要“因地制宜”，根据每群细胞各自的特性（比如各自的中位值），然后结合一定的统计指标（例如3倍的MAD）
- 过滤的细胞会不会属于某一个具有生物意义的细胞类群，如果真的是，那么就会有相应的marker基因高表达。
3 初步看一下
先做一个散点图，重点看看有没有基因明显向舍弃细胞方向偏移：
# 计算丢弃和保留的细胞平均表达量(这里的平均表达量不是我们直接用apply+mean得出的结果，它计算了size factor
library(SingleCellExperiment)
sce.full.416b <- readRDS("416B_preQC.rds")
library(scater)
lost <- calcAverage(counts(sce.full.416b)[,!sce.full.416b$PassQC])
kept <- calcAverage(counts(sce.full.416b)[,sce.full.416b$PassQC])
# 在上面得到的平均值中，将每个数都与平均值中（除0以外）最小的数进行比较，取最大的那个值作为最终的平均值
capped.lost <- pmax(lost, min(lost[lost>0]))
capped.kept <- pmax(kept, min(kept[kept>0]))
plot(capped.lost, capped.kept, xlab="Average count (discarded)",
ylab="Average count (retained)", log="xy", pch=16)
is.spike <- isSpike(sce.full.416b)
points(capped.lost[is.spike], capped.kept[is.spike], col="red", pch=16)
is.mito <- rowData(sce.full.416b)$is_feature_control_Mt
points(capped.lost[is.mito], capped.kept[is.mito], col="dodgerblue", pch=16)
calcAverage具体操作如下：The size-adjusted average count is defined by dividing each count by the size factor and taking the average across cells. All sizes factors are scaled so that the mean is 1 across all cells, to ensure that the averages are interpretable on the scale of the raw counts.
图中表示了舍弃的细胞和保留的细胞中基因平均表达量。每个点是一个基因，红色是spike-in，蓝色是线粒体基因
看到：整体方向还是偏向于y轴，虽然也有个别的点是偏向右下方的，下面👇就看看最偏右下方的那些点到底是不是marker基因？
4 认真再检查一下
方法就是：计算retain和discard两组细胞的基因表达量差异倍数（ log-fold changes）。
核心就是：利用了edgeR的predFC函数，因为我们并不关心这两组之间的差异，这是想看看哪些基因在discard组更高表达一些。于是用这个函数分别根据每个组的表达量，再设置一个design实验设计矩阵就可以。没有正常做差异分析那么严格
library(edgeR)
#!! 重点在于DGEList中group的设置：数小的是control，也就是logFC的分母(自己也可以将group调换一下试试，结果看看是不是相反的)
y <- cbind(lost, kept)
y <- DGEList(y, group=c(2,1))
design <- model.matrix(~group, data=y$samples)
predlfc <- predFC(y, design)[,2]
info <- data.frame(logFC=predlfc, Lost=lost, Kept=kept,
row.names=rownames(sce.full.416b))
head(info[order(info$logFC, decreasing=TRUE),], 20)
# edgeR实验设计矩阵长这样：
> design
(Intercept) group2
lost 1 1
kept 1 0
attr(,"assign")
[1] 0 1
attr(,"contrasts")
attr(,"contrasts")$group
[1] "contr.treatment"
结果就得到了：
## logFC Lost Kept ## ENSMUSG00000104647 6.844237 7.515034 0.000000000 ## Nmur1 6.500909 5.909533 0.000000000 ## Retn 6.250501 10.333172 0.196931018 ## Fut9 6.096356 4.696897 0.010132032 ## ENSMUSG00000102352 6.077614 9.393793 0.206637368 ## ENSMUSG00000102379 6.029758 4.244690 0.000000000 ## 1700101I11Rik 5.828821 4.483094 0.039199404 ## Gm4952 5.698380 6.580862 0.172999108 ## ENSMUSG00000106680 5.670156 3.389236 0.005234611 ## ENSMUSG00000107955 5.554616 5.268508 0.132532601 ## Gramd1c 5.446975 4.435342 0.103783669 ## Jph3 5.361082 4.696897 0.139188080 ## ENSMUSG00000092418 5.324462 3.395752 0.056931488 ## 1700029I15Rik 5.316226 8.199510 0.394588776 ## Pih1h3b 5.307439 2.546814 0.000000000 ## ENSMUSG00000097176 5.275459 2.541927 0.003772842 ## Olfr456 5.093383 2.186536 0.000000000 ## ENSMUSG00000103731 5.017303 3.315016 0.107148909 ## Klhdc8b 4.933215 19.861036 1.635081878 ## ENSMUSG00000082449 4.881422 1.878759 0.000000000
挑出来top20在discard中相对高表达的基因，但其中并没有marker基因，这就足够了。不用关心logFC的实际数值，眼前的高可能是因为细胞破损后，计算得到的线粒体基因、细胞质核糖体基因或者核RNA占比升高，计算出来的的表达量也升高，因而比正常的细胞要高，不过这是一种“虚假繁荣”的假象而已。
5 如何避免丢失一些细胞类型
最直接的方法就是修改（上面4.2中isOutlier函数的nmads=参数） ，另外如果我们知道哪些细胞属于什么细胞类型，也可以提前定义出来避免过滤掉。最粗暴的还是不进行任何的细胞过滤，这样虽然确保了不会丢失，但同时增加了无用细胞的占比。因此，要不要过滤、怎么过滤还是要取决于个人的安排。
不得不说，得到的细胞质量和细胞类型还真有一定的关系。如果某种细胞就是在细胞提取阶段不配合，导致后来检测到这群细胞都有损伤，最好还是在保证实验设计的前提下去掉它们=》“牺牲小我保存大我”
6 其他一些质控方法
- 使用固定的阈值：比如设置文库大小阈值为100000，表达基因数量4000。但是这些都需要具有实际的经验，最好还是不要乱设置这些值，因为很有可能会由于自己的随意发挥，而抛弃了一些珍贵的细胞类型
- 看基于质控结果进行PCA分析的离群点： 前期会对每个细胞统计总reads数、总基因数等6个指标，然后用这些指标进行PCA。具体
runPCA的设置如下图：
如果PCA的结果有离群点，就说明在这些指标中（不论太大或太小）某些细胞是“脱离群众的”。举个例子：
sce.tmp <- runPCA(sce.full.416b, use_coldata=TRUE, detect_outliers=TRUE) ## ## FALSE TRUE ## 187 5
- 另外还可以参考2019年出的cellity包
7 一个“太随意”的错误案例
例如：在没有任何先验知识情况下，我们直接对一个单细胞对象中一个统计指标（total_counts）设置一个阈值（1000）进行过滤：
wrong.keep <- sce.pbmc$total_counts >= 1000
lost <- calcAverage(counts(sce.pbmc)[,!wrong.keep])
kept <- calcAverage(counts(sce.pbmc)[,wrong.keep])
# 然后同上面一样做一个散点图
# Avoid loss of points where either average is zero.
capped.lost <- pmax(lost, min(lost[lost>0]))
capped.kept <- pmax(kept, min(kept[kept>0]))
plot(capped.lost, capped.kept, xlab="Average count (discarded)",
ylab="Average count (retained)", log="xy", pch=16)
platelet <- c("PF4", "PPBP", "SDPR")
points(capped.lost[platelet], capped.kept[platelet], col="orange", pch=16)
很明显，这个图有点向下偏，也就是说有一些基因在discard组中表达量更多。然后测试了3个血小板相关的基因（橘黄色），发现它们确实在discard组中表达量更高，说明其中有部分血小板细胞被丢掉了
接着用logFC再检验一下：
coefs <- predFC(cbind(lost, kept), design=cbind(1, c(1, 0)))[,2]
info <- data.frame(logFC=coefs, Lost=lost, Kept=kept,
row.names=rownames(sce.pbmc))
head(info[order(info$logFC, decreasing=TRUE),], 20)
## logFC Lost Kept
## PF4 6.615671 4.2289086 0.17421441
## PPBP 6.495522 4.8409530 0.27144834
## HIST1H2AC 6.291680 3.1195253 0.14435051
## GNG11 6.162314 2.5132359 0.10103056
## SDPR 5.950336 2.1430640 0.09754273
## TUBB1 5.610679 1.6478079 0.08989034
## CLU 5.462238 1.3202347 0.05559122
## ACRBP 5.325560 1.1933566 0.05436568
## NRGN 5.118699 1.3155255 0.12992550
## RGS18 5.009974 1.6512487 0.25377562
## MAP3K7CL 4.898185 0.9950268 0.08957073
## SPARC 4.646432 0.6559761 0.02487467
## MMD 4.616159 0.7450948 0.06367575
## PGRMC1 4.503524 0.7335820 0.08248177
## CMTM5 4.166574 0.4469937 0.01643304
## TSC22D1 4.120268 0.5128047 0.05920195
## HRAT92 4.116163 0.4214188 0.01144488
## GP9 4.091146 0.4610813 0.03703803
## CTSA 3.986470 0.8294337 0.27097756
## MARCH2 3.966528 0.5655020 0.12228759
发现，血小板几个相关基因的确在discard组中更高，说明之前按照sce.pbmc$total_counts >= 1000的过滤是错误的。而不检查有没有先验知识的话，后面分群我们也得不到这部分细胞