CellRanger单细胞转录组分析教程(三) 使用初探

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首先对上次改好名称的fastq数据进行质控

# 以P2586-4为例
mkdir -p $wkd/qc
cd $wkd/qc
find $wkd/raw/P2586-4 -name '*R1*.gz'>P2586-4-id-1.txt
find $wkd/raw/P2586-4 -name '*R2*.gz'>P2586-4-id-2.txt
cat P2586-4-id-1.txt P2586-4-id-2.txt >P2586-4-id-all.txt

cat P2586-4-id-all.txt| xargs fastqc -t 20 -o ./
CellRanger走起(三) 使用初探CellRanger走起(三) 使用初探

然后利用Filezilla下载其中SRR7722937的R1、R2的html，打开看下

首先是R1的，这个就是16bp Barcode+10bp UMI，可以看到Phred值是比较稳定的

CellRanger单细胞转录组分析教程(三) 使用初探-图片1

然后看下真实的测序数据：它的Phred值开始质量较差，中间较好，测序结束位置质量有下降，这是和测序仪的工作原理有关的

测序仪在刚开始进行合成反应的时候也会由于反应还不够稳定，会带来质量值的波动；碱基的合成利用的的是聚合酶化学反应，使得碱基可以从5’端向3’端合成并延伸。但合成的过程中随着链的增长，DNA聚合酶的效率会不断下降，特异性也开始变差，越到后面碱基合成的错误率就会越高）

总体上还是在Q30以上的，数据质量不错，并且没有接头序列

CellRanger单细胞转录组分析教程(三) 使用初探-图片2

如果要对Fastqc结果进行详细的了解，可以去官网的帮助信息，非常的简明扼要：<https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/3%20Analysis%20Modules/

Cell Ranger的介绍

什么是Cell Ranger？

官网的说明最原汁原味：
Cell Ranger is a set of analysis pipelines that process Chromium single cell 3’ RNA-seq output to align reads, generate gene-cell matrices and perform clustering and gene expression analysis.

到目前为止，它有1.0，1.1，1.2，1.3，2.0，2.1，2.2，3.0这8个版本，其中1.2版本之后的可以支持Chromium Single Cell 3' v1 and v2 试剂，最新的V3试剂需要用到3.0版本

要分析的文章中使用了两个不同的版本（2.0和2.1）去分析两个患者的数据：

CellRanger单细胞转录组分析教程(三) 使用初探-图片3
那么这个软件能干什么事？

它主要包括四个主要基因表达分析流程：

  • cellranger mkfastq ： 它借鉴了Illumina的bcl2fastq ，可以将一个或多个lane中的混样测序样本按照index标签生成样本对应的fastq文件
  • cellranger count ：利用mkfastq生成的fq文件，进行比对(基于STAR)、过滤、UMI计数。利用细胞的barcode生成gene-barcode矩阵，然后进行样本分群、基因表达分析
  • cellranger aggr ：接受cellranger count的输出数据，将同一组的不同测序样本的表达矩阵整合在一起，比如tumor组原来有4个样本，PBMC组有两个样本，现在可以使用aggr生成最后的tumor和PBMC两个矩阵，并且进行标准化去掉测序深度的影响
  • cellranger reanalyze ：接受cellranger count或cellranger aggr生成的gene-barcode矩阵，使用不同的参数进行降维、聚类

它的结果主要是包含有细胞信息的BAM, MEX, CSV, HDF5 and HTML文件

相关的术语
  • Sample：（样本）从单一来源(比如血液、组织等)提取的细胞悬液
  • Library：（文库）单个样本制备的10X barcode 测序文库，对应10X Chromium Controller一个run（即运行一次）的单个芯片通道
  • Sequencing Run / Flowcell: 测序仪主要依靠flowcell（例如Hiseq4000就有2个flowcell），每运行一次就是run一次，数据会在flowcell上产出，然后这些数据又会根据flowcell上的不同lane以及lane上不同样本的index进行区分
  • 以上术语的错综复杂：
    • 单独一个样本可以制备成多个文库，这样可以一次run就得到更多的细胞数量，而不用在单次run的单个文库中使用全部的样品，造成"过载"现象("过犹不及")
    • 单独一个样本可以跨多个flowcell测序，如果它们是在一次测序过程中产出，就可以将产出的reads合并
    • 上面说一个文库可以用多个flowcell，那么一个flowcell也可以包含多个文库，使用不同的lane上或者样本的index进行区分
    • 同一个10x 芯片的两个channels可以说是两个文库，但是两个不同芯片的同一个channel不能说是两个文库
大体流程

主要根据sample、library、flowcell的数量来定义分析的复杂程度(由浅入深)

  • 一个sample、一个library、一个flowcell
    CellRanger单细胞转录组分析教程(三) 使用初探-图片4

    这是最基本的模式：只有一个生物样本，只需要制备一个文库，在一个flowcell上测序就好，通过mkfastq得到fastq文件后直接运行count 就好(具体见： Single-Library Analysis)

  • 一个library，多个flowcell
    CellRanger单细胞转录组分析教程(三) 使用初探-图片4

    如果有个文库在多个flowcell上测序，可以利用 Running Multi-Library Samples 将不同测序run的reads混合

  • 一个sample，多个library
    CellRanger单细胞转录组分析教程(三) 使用初探-图片4

    如果一个样本有多个文库(比如做了技术重复)，那么每一个文库的数据应该单独跑cellranger count 流程，然后可以利用aggr整合起来， Multi-Library Aggregation ；
    当然先将一个样本的多个文库组合在一起再分析也是可以的，就需要利用到 MRO syntax (这里先做了解)

  • 多个samples
    CellRanger单细胞转录组分析教程(三) 使用初探-图片4

    必须每个样本的每个文库单独跑cellranger count ，比如说：实验中有4个样本，每个样本由两个文库(或者两个技术重复)，那么就需要跑count 流程8次，最后利用aggr汇总在一起

Cell Ranger的安装与配置

系统要求
  • Linux 至少8核CPU(推荐16核)
  • 64GB RAM(推荐128GB)，最低配的64G允许cellranger aggr合并最多250k个细胞
  • 1T硬盘
  • 64-bit CentOS/RedHat 6.0 or Ubuntu 12.04
软件依赖

大多软件是和Cell Ranger打包在一起的，但是cellranger mkfastq 依然需要Illumina bcl2fastq (要求版本2.17以上；如果使用Novaseq，最好用版本2.20或者更高)

使用资源限制

Cell Ranger默认在本地运行(或者使用--jobmode=local指定)，它会占用90%的空余内存以及所有空余的CPU。如果要进行资源限制，可以使用—localmem或者--localcores

使用localcores之前，应该先检查ulimit -u，看看服务器最大支持多少用户同时在线，因为cellranger使用一个核就会产生64个用户队列，不能超过这个限定值。例如检查ulimit -u为4096，那么最多设置64个核心，也就是64 * 64 = 4096 ，才不会因为这个报错

下载软件

为了复现文章，我们需要用到Cell Ranger 2.0与2.1，其中2.0版本是2017年9月发布的，2.1版本是2018年2月发布的

# 2.0版本下载(732M)
curl -o cellranger-2.0.2.tar.gz "http://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-2.0.2.tar.gz?Expires=1557256518&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cDovL2NmLjEweGdlbm9taWNzLmNvbS9yZWxlYXNlcy9jZWxsLWV4cC9jZWxscmFuZ2VyLTIuMC4yLnRhci5neiIsIkNvbmRpdGlvbiI6eyJEYXRlTGVzc1RoYW4iOnsiQVdTOkVwb2NoVGltZSI6MTU1NzI1NjUxOH19fV19&Signature=HoJUuPo4iTFdQgzFU1GH7uKf3uGitQxTjB6WOA9qGPlejf7tNcBPjO65WuSUZ~w8WWdeAvky-oV7XGfheY-bUr2b7QHr7jQEqc84cyU~PLvT~fYjkgC7cG7nlpbJOT~b7U~YH9amvR~SCLlyynp7scPDIA~9~keCYrIPgevTf2QyktybuSyjNTwugefOic~~XFkc9lrS~WQ9MNA1CLl4ExlQKsxWS77PEB6mwrMZXX65obDnZW9fIs3dIny6H5YoadbkgmsT52jmLien6PsG1g2jpAO90pPuHoru8LL64Q9gmB3I0nJAqi3EmrO3GKnUpHUhGb6doKmjSN6XccpmsA__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"
# 2.1版本下载
curl -o cellranger-2.1.1.tar.gz "http://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-2.1.1.tar.gz?Expires=1557260110&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cDovL2NmLjEweGdlbm9taWNzLmNvbS9yZWxlYXNlcy9jZWxsLWV4cC9jZWxscmFuZ2VyLTIuMS4xLnRhci5neiIsIkNvbmRpdGlvbiI6eyJEYXRlTGVzc1RoYW4iOnsiQVdTOkVwb2NoVGltZSI6MTU1NzI2MDExMH19fV19&Signature=RNQd-gTASTQhtnUSBfQWrnqo6Pyy2wDXtV5tlxkG97727GvoRhMqFXbEsz4gJl2BMckdVvW3S1tZRwRo5pmxPzmhq-8RKxf99pGqlzo84HYqhbIRkxXlIbLbj-u3PUJqo8cesWpbSVSKkS2TCNS-9GMFNieQswqMS2-DN4BqoBOJnWr7T4wlOMd9hypXWwOsW2P2fqaM-WP2ooMyo-oIxm3y9gDghXdDEP5lvHU7GCQcFGGexkdIrD6S5p8JPJ1DB5XieGrtEuP1YVp6tLMGXFoRWXS8dQLI1egWDYlOuRaiQgLIb3o5ZxBg5NpzLPP5kDHMAVzJFdBpf~~rkyNYTA__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"

软件下载完，需要解压缩一段时间，因为它打包了太多的软件和资源

tar zxvf cellranger-2.0.2.tar.gz

然后添加环境变量(注意：如果之前安装过其他版本，比如我之前装过3.0，但是当前你只想用这个2.0版本，那么就需要在~/.bashrc中将新安装的2.0版本路径放在3.0的下方，因为linux是根据$PATH自上而下调用软件的，将新安装的路径放在.bashrc下方，那么在$PATH中显示的就是新路径在上方，它们的顺序是相反的)

# 举个例子
# 原来我的~/.bashrc中有个cell ranger 3.0
echo 'export PATH=/home/biosoft/cellranger-2.2.0:$PATH' >> ~/.bashrc
# 现在我想输入cellranger时先调用2.0版本，那就在3.0的下方写上
export PATH=/home/biosoft/cellranger-3.0:$PATH
export PATH=/home/biosoft/cellranger-2.0.2:$PATH
# 然后保存退出，激活环境变量
# 这时查看环境变量
echo $PATH
/home/biosoft/cellranger-2.0.2:/home/biosoft/cellranger-3.0
# 于是输入cellranger，给出的帮助文档就是
cellranger  (2.0.2)
Copyright (c) 2017 10x Genomics, Inc.  All rights reserved.
-------------------------------------------------------------------------------

Usage:
    cellranger mkfastq

    cellranger count
    cellranger aggr
    cellranger reanalyze
    cellranger mkloupe
    cellranger mat2csv

    cellranger mkgtf
    cellranger mkref

    cellranger vdj

    cellranger mkvdjref

    cellranger testrun
    cellranger upload
    cellranger sitecheck
# 成功切换了版本！

然后安装好以后，cellranger还提供了一个小工具(我认为是个有意思的地方)，让你全面了解你的linux性能，不用自己找代码。另外这些代码我们也可以借鉴，以后再用

$ cellranger sitecheck > sitecheck.txt
CellRanger单细胞转录组分析教程(三) 使用初探-图片5

为了确保软件所有的自带流程都成功安装，可以进行一个软件自检

cellranger testrun --id=tiny
# 我使用了12个CPU，大约需要20分钟检查完
# 如果成功完整地安装的话，最后会给出这样一个报告：
cellranger testrun (2.0.2)
Copyright (c) 2017 10x Genomics, Inc.  All rights reserved.
-------------------------------------------------------------------------------

Running Cell Ranger in test mode...

Martian Runtime - 2.0.2-2.2.2

Running preflight checks (please wait)...
[runtime] (ready)           ID.tiny.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.SETUP_CHUNKS
[runtime] (split_complete)  ID.tiny.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.SETUP_CHUNKS
...

Pipestance completed successfully!
参考序列下载(1.2.0版本，2016年12月发布)

文章比对到了hg38(基于ensembl数据库)，不能直接使用网站下载的基因组与注释文件，需要过滤一下

如果直接下载的话一共11GB，当然这里面包含了基因组、注释源文件，以及cell ranger自己利用mkgtf构建的注释和mkref构建的基因组

curl -O http://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0.tar.gz
# 然后解压
tar -xzvf refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0.tar.gz
CellRanger单细胞转录组分析教程(三) 使用初探-图片6

如果要自己尝试构建，可以使用

# 下载基因组
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
# 下载注释
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf.gz
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf.gz
# 软件构建注释(可以自选attribute)
# mkgtf <input_gtf> <output_gtf> [--attribute=KEY:VALUE...]
cellranger mkgtf Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf Homo_sapiens.GRCh38.84.filtered.gtf 
                 --attribute=gene_biotype:protein_coding 
                 --attribute=gene_biotype:lincRNA 
                 --attribute=gene_biotype:antisense 
                 --attribute=gene_biotype:IG_LV_gene 
                 --attribute=gene_biotype:IG_V_gene 
                 --attribute=gene_biotype:IG_V_pseudogene 
                 --attribute=gene_biotype:IG_D_gene 
                 --attribute=gene_biotype:IG_J_gene 
                 --attribute=gene_biotype:IG_J_pseudogene 
                 --attribute=gene_biotype:IG_C_gene 
                 --attribute=gene_biotype:IG_C_pseudogene 
                 --attribute=gene_biotype:TR_V_gene 
                 --attribute=gene_biotype:TR_V_pseudogene 
                 --attribute=gene_biotype:TR_D_gene 
                 --attribute=gene_biotype:TR_J_gene 
                 --attribute=gene_biotype:TR_J_pseudogene 
                 --attribute=gene_biotype:TR_C_gene

# 我看到这里写了这么多gene_biotype（也就是基因的生物类型）的键值对，不禁好奇，GTF中存在多少种基因类型以及对应的数目？
$ cat Homo_sapiens.GRCh38.84.filtered.gtf  |grep -v "#" |awk -v FS='gene_biotype ' 'NF>1{print $2}'|awk -F ";" '{print $1}'|sort | uniq -c

    213 "IG_C_gene"
     33 "IG_C_pseudogene"
    152 "IG_D_gene"
     76 "IG_J_gene"
      9 "IG_J_pseudogene"
   1209 "IG_V_gene"
    646 "IG_V_pseudogene"
    125 "TR_C_gene"
     16 "TR_D_gene"
    316 "TR_J_gene"
     12 "TR_J_pseudogene"
    848 "TR_V_gene"
    110 "TR_V_pseudogene"
  45662 "antisense"
  58181 "lincRNA"
2337766 "protein_coding"


# 软件利用构建好的注释，去构建需要的基因组
cellranger mkref --genome=GRCh38 
                 --fasta=Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa 
                 --genes=Homo_sapiens.GRCh38.84.filtered.gtf 
                 --ref-version=1.2.0

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