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1. 学习目标

• 讨论ChIP-seq数据质量评估的其他方法
• 用ChIPQC产生质量统计报告
• 鉴定低质量数据的来源

• 概览图

ENCODE评估数据质量采用多种指标，如前面已经讨论过的链相关的指标NSC和RSC。这一节将会讨论评估信号分布的其他指标。

NOTE：这里给出的评估指标只是反映数据质量的好坏，符合阈值的并不意味着实验是成功的，不符合阈值的也不一定意味着失败。

2.常见质量评估指标的介绍

• SSD

  SSD值是对富集效果的评估。SSD值依赖于全基因组的pile-up信号强度，对真实的ChIP富集和干扰的强信号区域都很敏感。SSD值越大表明富集越好。

  “It provides a measure of pileup across the genome and is computed by looking at the standard deviation of signal pile-up along the genome normalised to the total number of reads. ”

• FRiP:Fraction of reads in peaks

  FRiP表示的是peaks中的reads与总reads的比例。它是另一个反映样本富集效果或IP好坏的评价指标。可以理解为是“信噪比”即文库中结合位点片段占背景reads的比例。一个典型质量好的TF富集FRiP值约5%或者更高，polII的FRiP值约为30%或者更高，也有一些质量好的数据FRiP值<1%（如RNAPIII）

• Relative Enrichment of Genomic Intervals (REGI)

  REGI是对peaks在不同基因组特征位点分布的统计。

• RiBL: Reads overlapping in Blacklisted Regions

  过滤人工造成的高信号区域非常重要，如ENCIDE和modENCODE提供的DAC Blacklisted Regions track。这些区域经常在特定的重复序列处出现，如着丝粒、端粒、卫星重复序列等，通过简单的比对过滤是不能去除的。来自blacklisted regions的信号会造成call peak 和片段长度评估的混淆。
  RiBL值可以表示背景信号或input的信号水平，与input sample的SSD值以及input和ChIP sample的读长覆盖值相关。这些区域通常是基因组的0.5%，或者更高的比例（10%）。
  

3. ChIPQC: quality metrics report

ChIPQC是一个Bioconductor包，输入文件包括BAM和peak文件，可以自动计算一些质量评估值，并产生质量报告。

准备数据

• BAM files
  首先对比对过滤后的bam数据（chr12_aln.bam）建索引，然后将bam和index文件从~/ngs_course/chipseq/results/bowtie2移动到自己的目录文件夹data/bams
• peak files
  将narrowPeak 文件从macs2目录下~/ngs_course/chipseq/results/macs2 移动到自己目录下data/peakcalls
• sampleSheet file
  sampleSheet file是唯一需要自己根据实验设计和数据存储地址等信息创建的一个csv格式文件（bam,peak文件分别在比对和call peak的步骤产生）。sampleSheet具体需要包含的信息如下：
  
• SampleID: 样本ID
• Tissue, Factor, Condition: 不同的实验设计对照信息，三列信息必须包含在sampleSheet里，如果没有某一列的信息设为NA。
• Replicate : 重复样本的编号
• bamReads : 实验组BAM 文件的路径（data/bams）
• ControlID : 对照组样本ID
• bamControl :对照组样本的bam文件路径
• Peaks :样本peaks文件的路径
• PeakCaller ：peak类型的字符串，可以是raw,bed,narrow,macs等。
  

  下载安装ChIPQC

  source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
  biocLite("ChIPQC")

Running ChIPQC

ChIPQC只需要三步就可以完成质量评估和报告生成。

• 首先载入包和sampleSheet信息
  

  ## Load libraries
  library(ChIPQC)
  ## Load sample data
  samples <- read.csv('meta/samplesheet_chr12.csv')
  View(samples)

• 创建ChIPQC对象
  利用sampleSheet的信息读取每个样本的bam和narrowpeak文件，并计算质量评估值，结果存在一个对象里。

  ## Create ChIPQC object
  chipObj <- ChIPQC(samples, annotation="hg19")

• 生成ChIPQC报告
  

  ## Create ChIPQC report
  ChIPQCreport(chipObj, reportName="ChIP QC report: Nanog and Pou5f1", reportFolder="ChIPQCreport")

ChIPQC报告解读

ChIPQC生成的结果包含一个网页报告和报告中含有的所有图片。
网页报告有三部分：QC Summary ；QC Results；QC files and versions

（1）QC Summary - Overview of results

QC summary包含sampleSheet里填写的样本的基本信息Tissue,Factor,Condition,Replicate。另外还有上面提到的质量评估的常用指标SSD、RiP%和RiBL值。越高的SSD值表明富集效果越好，Pou5f1样本（2.6,3）有较高的SSD值，RiBL值不是很高，FRiP的比例在5%附近或者更高，除了Pou5f1-rep2。

• SSD - SSD score (htSeqTools)
• RIP% - Percentage of reads wthin peaks
• RIBL% - Percentage of reads wthin Blacklist regions
  同时表格中还给出了其他统计信息：
• Reads - Number of sample reads within analysed chromosomes.
• Dup% - Percentage of MapQ filter passing reads marked as duplicates
• FragLen - Estimated fragment length by cross-coverage method
• FragLenCC - Cross-Coverage score at the fragment length
• RelativeCC - Cross-coverage score at the fragment length over Cross-coverage at the read length

（2）QC Results - Full QC results and figures

• Mapping, Filtering and Duplication rate
  第一部分是比对、过滤和重复率质检结果，包括Table2 、Figure1和Figure2。
  Table 2主要给出了比对质量和重复率，因为BAM文件是过滤后的，所以这里Dup%都是0.
  

  • Total Dup%-Percentage of all mapped reads which are marked as duplicates.
  • Pass MapQ Filter%-Percentage of all mapped reads whichpass MapQ quality filter
  • Pass MapQ Filter and Dup%-Percentage of all reads which pass MapQ filter and are marked asduplicates.

Figure 1展现了reads在blacklists中的比例，

Figure 2是用基因组注释呈现了reads在基因组特征位置如启动子的分布。这幅图里显示在启动子区域富集最明显。

• ChIP signal Distribution and Structure
  第二部分是ChIP信号分布和结构组成，包括Figure3和4。
  Figure 3是一个coverage plot， x轴代表在某bp位置read pileup的高度，y轴代表有多少位置有相同的pileup 高度(取log)。**有好的富集的ChIP样本会有一个tail，即更多的位置（y值大）有较高的测序深度。在我们的数据集中Nanog样本与Pou5f1 相比有较高的tails,尤其是重复样本2。但是Pou5f1有较高的SSD值。当SSD高但是coverage看起来低时，可能是存在大片段深度高的区域出现在blacklist 基因组区域。
• Peak Profile and ChIP Enrichment
  第3部分是peak的谱图和ChIP的富集，每个peak都集中在summit位置（summit 理解为peak的最高峰值点处）
• peak的性状取决于研究对象的类型，如转录因子、组蛋白标记、或其他DNA结合蛋白如聚合酶等，相同类型的对象通常有独特特征的谱图。
  Figure6和7都是对比对到peak中的reads统计。富集效果好的ChIP样本的reads与peaks会有高比例的重合。尽管Nanog有较高的RiP,但是两个重复样本间的差异大于Pou5f1。
• Figure8和9**表示样本的聚类效果，分别是相关性聚类热图和PCA。

4. 实验偏差：ChIP-seq数据质量低的来源

• 免疫沉淀的特异性和有效性
  影响因素如抗体的特异性，结和沉淀的强度
• 片段化
  超声裂解产生不同大小的片段可能引入偏差
• 文库构建时的偏差
  如PCR扩增