表达谱芯片的聚类分析

【在国际上，R软件的应用是数据分析的主流发展趋势之一，但我发现在国内R软件的使用远不如SPSS、SAS等软件那么流行。为推广R软件的使用，本博客将陆续推出“R高级教程”系列专辑，希望对生命科学领域的科技工作者有少许帮助......】

通常来讲，对于一般的统计分析，基于傻瓜式操作的SPSS（PASW）软件已经足够，但在涉及个性化要求很高的复杂数据处理时，SPSS就开始显得力不从心，这时必须依赖功能更为强大的SAS等软件。以前在自己的科研过程中分析数据多用SPSS、SAS等。在统计遗传和基因组学领域，SAS可以处理很多问题，但与此同时，SAS实现复杂问题过于麻烦，很多问题SAS也不是首选。后来开始运用R环境中的各种免费统计包，特别是Bioconductor的系列分析包，我发觉非常适合生命科学领域的研究者。R有很多优点：

（1）免费，不需要去寻找破解版，不用担心版权问题，使用非常方便；

（2）功能非常强大，单个包的功能比较有限，但多个包组合起来使用则功能无比强大，远胜于SPSS、SAS等；

（3）源代码开放，稍作修改后就能满足个性化的复杂统计分析，满足个性化需求是R的最大特点之一；

（4）程序阅读容易，再加上参考学习资料很多，上手比较容易，提高也不是很难，根据个人经验，要比SAS高级阶段的进阶容易许多；

（5）国际同行高度认同R，我发现很多专用软件都开发了软件的R版，今后R将是数据分析的主流发展方向。

R软件的安装、基本使用等初级教程就不谈了，随便在官方网站找个学习资料就搞定了。“R系列”专辑拟推出中级、高级分析教程。今天推出基因表达谱芯片的聚类分析专题。

本专题示例芯片数据来自GEO数据库中检索号为GSE11787 的Affymetrix芯片的CEL文件，共6个CEL文件，3个正常对照组，3个HPS刺激组，为免疫器官脾脏的表达数据。

（一）原始数据的读入、RNA降解评估和标准化

> pd <- read.AnnotatedDataFrame("Target.txt",header=TRUE,row.names=1,as.is=TRUE)

>rawAffyData <- ReadAffy(filenames=pData(pd)$FileName, phenoData=pd)

> summary(exprs(rawAffyData))

> deg <- AffyRNAdeg(rawAffyData)

> plotAffyRNAdeg(deg, col=c(1,2,3,4,5,6))

> eset <- rma(rawAffyData)

> summary(exprs(eset))

> op <- par(mfrow=c(1,2))

>cols <- brewer.pal(6, "Set3")

>boxplot(rawAffyData,col=cols,names=1:6, main = "unnormalized.data")

>boxplot(data.frame(exprs(eset)) ,names=1:6, main = "normalization.data", col="blue", border="brown")

>par(op)

（二）聚类分析

原始数据读入，经AffyBatch目标转成ExpressionSet目标后，为提高后续分析（如差异表达基因的检测）的统计功效，往往需要进一步经过Detection Call Filter和IQR filter等过滤（“基因芯片数据的特异性过滤与非特异性过滤”将在另一专题里专门讨论）。

需要说明的是，常规做法是先筛选出差异表达基因，然后只用差异表达基因进行聚类分析（本示例直接用了过滤后的数据集，聚类图的效果稍差一点）。

（1）样本聚类

>dd <- dist2(log2(exprs(eset2)))

>diag(dd) <- 0

>dd.row <- as.dendrogram(hclust(as.dist(dd)))

>row.ord <- order.dendrogram(dd.row)

>library("latticeExtra")

>legend <- list(top = list(fun = dendrogramGrob,

args = list(x = dd.row, side = "top")))

>lp <- levelplot(dd[row.ord, row.ord], scales = list(x = list(rot = 90)), xlab = "", ylab = "", legend = legend)

>plot(lp)

（2）二维聚类

>source("http://faculty.ucr.edu/~tgirke/Documents/R_BioCond/My_R_Scripts/my.colorFct.R")

>mydata<-exprs(eset2)

>mydatascale <- t(scale(t(mydata)))

>hr <- hclust(as.dist(1-cor(t(mydatascale), method="pearson")), method="complete")

>hc <- hclust(as.dist(1-cor(mydatascale, method="spearman")), method="complete")

>heatmap.2(mydata, Rowv=as.dendrogram(hr), Colv=as.dendrogram(hc), col=redgreen(75), scale="row", ColSideColors=heat.colors(length(hclabels)),RowSideColors=heat.colors(length(hrlabels)), trace="none", key=T)

上述聚类图一般和论文里的聚类图有点不同，聚类的模式不太直观，你也可以用下面的语句进行更直观的作图：

>mycl <- cutree(hr, h=max(hr$height)/1.5);

>mycolhc <- sample(rainbow(256)); mycolhc <- mycolhc[as.vector(mycl)]

>myc2 <- cutree(hc, h=max(hc$height)/1.5); mycolhr <- sample(rainbow(256)); mycolhr <- mycolhr[as.vector(myc2)]

>heatmap(mydatascale, Rowv=as.dendrogram(hr), Colv=as.dendrogram(hc), col=my.colorFct(), scale="row", ColSideColors=mycolhr, RowSideColors=mycolhc)

（3）MantelCorrs聚类程序

>kmeans.result <- GetClusters(eset2, 500, 100)

>x=exprs(eset2)

>DistMatrices.result <- DistMatrices(x, kmeans.resultclusters)>MantelCorrs.result<−MantelCorrs(DistMatrices.resultDfull,DistMatrices.resultDsubsets)>permuted.pval<−PermutationTest(DistMatrices.resultDfull, DistMatrices.resultDsubsets,100,16,0.05)>ClusterLists<−ClusterList(permuted.pval,kmeans.resultcluster.sizes,MantelCorrs.result)

>ClusterGenes <- ClusterGeneList(kmeans.resultclusters,ClusterListsSignificantClusters,eset2)

>h=hclust(dist(MantelCorrs.result))

>plot(h)

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