DNA甲基化是生命发育调控的重要手段。一个人全身各处细胞中DNA序列基本一致，但是各种分化的细胞可以特异性地分化出各种功能，表观的调控起了绝大部分的作用。而表观的调控中，甲基化的修饰又是重中之重。
甲基化的检测手段已有很多，基本原理大都依赖于亚硫酸氢盐处理，把未甲基化的C转化成U，U再在后续的PCR中变成T。通过各种手段分析突定位点是C、还是T，就可以判断出这个位点是否被甲基化了。
基于PyroSequencing测序原理的测序方法，是这许多种甲基化分析中的金标准。
PyroSequencing成为甲基化测序金标准的原因：
分析的核心目标是异质性DNA甲基化的比例定量，也就是说，对于某个特定的基因位点来说，50个细胞里的总共100个拷贝中，可能只有30的拷贝是甲基化的，还有70个拷贝是没有甲基化的。现在要分析的内容就是有多少比例是甲基化的、还有多少是没有甲基化的。
PyroSequencing做甲基化分析的优点
可以针对性地对特定们置C和T两种分两个cycle分别测序，C和T之间没有信号交叉，结果清楚明了
对于C和T的比例，也就可以很方便地判定
下图是PyroSequencing测甲基化的实图
二代测序还不能很好地测定甲基化：
Illumina平台，对测序样本要求4种碱基比较平均，这样测4种碱基的4色照片上的光点比较均一，软件比较好判别。但是亚硫酸氢盐处理过后，99%的C都变成了T，这导致T太多，而C太少。测序的效果就下降。虽然加PhiX等平衡文库可以补救一些，但是效果还不是最好。
Ion Torrent平台，对于同聚物（homopolymer，也就是一串连续的A，或一串连续的T这种序列）一直测不太准。99%的C变T之后，同聚物现象就很严重。Ion Torrent平台就测不太好。
二代测序的费用，目前还是比较高的。
Sanger法测序，对于低Allele frequency测不好
Sanger法的特点是，C和T在同一个位置出现，而因为四色荧光解析的原因，同一位置的C和T会相互干扰，这导致灵敏度的大幅下降，实际的灵敏度只能测到最低20%的Allele Frequency(100个拷贝中有几个甲基化的)
Sequenom质谱法
- 可以测甲基化，但是要PCR，再转成RNA，再把RNA片段切断，最后上质谱
- 过程较为复杂，还有RNA的过程（RNA易降解），可靠性就不够高
PCR方法
原理：用3'末端特异碱基的PCR引物进行PCR反应。
因为酶对引物3'末端不同的碱基有不同的亲合力，PCR的指数效应又会放大这一偏差，所以要定量的话，不一定准确
附PyroSequencing测序原理视频：
原文来自：陈巍学基因