SAM/BAM文件处理

当测序得到的fastq文件map到基因组之后，我们通常会得到一个sam或者bam为扩展名的文件。SAM的全称是sequence alignment/map format。而BAM就是SAM的二进制文件(B取自binary)。 那么SAM文件的格式是什么样子的呢？如果你想真实地了解SAM文件，可以查看它的说明文档。SAM由头文件和map结果组成。头文件由一行行以@起始的注释构成。而map结果是类似下面的东西：

HWI-ST1001:137:C12FPACXX:7:1115:14131:66670 0 chr1 12805 1 42M4I5M * 0 0 TTGGATGCCCCTCCACACCCTCTTGATCTTCCCTGTGATGTCACCAATATG CCCFFFFFHHGHHJJJJJHJJJJJJJJJJJJJJJJIJJJJJJJJJJJJIJJ AS:i:-28 XN:i:0 XM:i:2 XO:i:1XG:i:4 NM:i:6 MD:Z:2C41C2 YT:Z:UU NH:i:3 CC:Z:chr15 CP:i:102518319 XS:A:+ HI:i:0
HWI-ST1001:137:C12FPACXX:7:2313:17391:30032 272 chr1 13494 1 51M * 0 0 ACTGCCTGGCGCTGTGCCCTTCCTTTGCTCTGCCCGCTGGAGACAGTGTTT CFFFFHHJJJJIJJJJIJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJHHHHFA+FFFC@B AS:i:-3 XN:i:0 XM:i:1 XO:i:0 XG:i:0NM:i:1 MD:Z:44G6 YT:Z:UU XS:A:+ NH:i:3 CC:Z:chr15 CP:i:102517626 HI:i:0
HWI-ST1001:137:C12FPACXX:7:1109:17518:53305 16 chr1 13528 1 51M * 0 0 CGCTGGAGCCGGTGTTTGTCATGGGCCTGGGCTGCAGGGATCCTGCTACAA #############AB=?:*B?;A?<2+233++;A+A2+<7==@7,A<A<=> AS:i:-5 XN:i:0 XM:i:2 XO:i:0 XG:i:0NM:i:2 MD:Z:8A21T20 YT:Z:UU XS:A:+ NH:i:4 CC:Z:chr15 CP:i:102517592 HI:i:0

看上去很类似fastq文件，它也有read名称，序列，质量等信息，但是又不完全一样。首先，每个read只占一行，只是它被tab分成了很多列，一共有12列，分别记录了：

1. read名称

2. SAM标记

3. chromosome

4. 5′端起始位置

5. MAPQ（mapping quality，描述比对的质量，数字越大，特异性越高）

6. CIGAR字串，记录插入，删除，错配以及splice junctions（后剪切拼接的接头）

7. mate名称，记录mate pair信息

8. mate的位置

9. 模板的长度

10. read序列

11. read质量

12. 程序用标记

显然，其中chromosome至CIGAR的信息都是非常重要的。但是这些对我们不重要，我们只需要了解SAM/BAM文件是什么，就可以了。重要的是如果进行下游的操作。 要操作SAM/BAM文件，首先需要安装samtools。它的安装过程和所有的linux/unix程序一样，都是经过make之后生成可执行程序，然后把它的路径告知系统，或者放在系统可以找到的位置就可以了。 比如：

 tar zxvf samtools-0.1.18.tar.bz2
 cd samtools-0.1.18/
 make
 samtoolpath=`pwd`
 PATH=PATH:$samtoolpath

然后就可以按照samtools主页上介绍的工具进行各种操作了。我们最常见的几步操作比如 0. SAM，BAM转换

 samtools view -h file.bam > file.sam
 samtools view -b -S file.sam > file.bam

1. sorting BAM文件。大多数下游程序都要求BAM文件是被排过序的。

samtools sort file.bam outputPrefix

2. 创建BAM index。这也是被大多数下游程序所要求。

samtools index sorted.bam

3. index模板基因组。这也是被大多数下游程序所要求。

samtools faidx Homo_sapiens_assembly19.fasta

在很多时候，我们还会看到一种扩展名为BED的mapping文件。其具体格式也是几经变化，但是现在以UCSC的描述为准。从BAM文件转换成BED文件，我们需要安装BEDtools。下载安装就不多说了。示例一个如何从BAM文件转换成BED文件的命令：

bamToBed -i reads.bam > reads.bed

更多的具体内容可以参见其说明文档。 当然，还有很多种格式来记录mapping的结果，大多数都收录在UCSC的帮助文档中。比如上次有人问及的.bw是什么文件（bigWig文件）之类的，都可以在那里找到答案。 上次谈及fastq文件时，有讲过其质量评估的问题，那么在mapping之后，如何对mapping的结果进行评估呢？ 最简单的，就是通过samtools来评估mapping质量了。

samtools idxstats aln.sorted.bam

注意，这一步之前需要经过sort和index。结果会显示：

 chr1 195471971 6112404 0
 chr10 130694993 3933316 0
 chr11 122082543 6550325 0
 chr12 120129022 3876527 0
 chr13 120421639 5511799 0
 chr14 124902244 3949332 0
 chr15 104043685 3872649 0
 chr16 98207768 6038669 0
 chr17 94987271 13544866 0
 chr18 90702639 4739331 0
 chr19 61431566 2706779 0
 chr2 182113224 8517357 0
 chr3 160039680 5647950 0
 chr4 156508116 4880584 0
 chr5 151834684 6134814 0
 chr6 149736546 7955095 0
 chr7 145441459 5463859 0
 chr8 129401213 5216734 0
 chr9 124595110 7122219 0
 chrM 16299 1091260 0
 chrX 171031299 3248378 0
 chrY 91744698 259078 0
 * 0 0 0

其中第一列是染色体名称，第二列是序列长度，第三列是mapped reads数，第四列是unmapped reads数。 如果是RNAseq，我们可以使用broad institute的RNA-SeQC来得到更加完整的报告。下载到文件之后，也许需要安装BWA来获取更精准的结果，但是如果不安装的话，也可以进行分析。一般来说，这一步不需要特别精准的结果，所以我很少使用BWA选项。下载的文件如果是.zip结尾的，直接把它改写成.jar就可以运行了。 在它的主页上下载所需要的Example RNA-seq Data。下载结束之后，该解压的解压缩。接下来运行：

 samtools index example/ThousandReads.bam
 samtools faidx example/Homo_sapiens_assembly19.fasta
 java -Xmx2048m -jar RNA-SeQC_v1.1.7.jar -n 1000 -s "TestId|example/ThousandReads.bam|TestDesc" -t example/gencode.v7.annotation_goodContig.gtf -r example/Homo_sapiens_assembly19.fasta -o ./testReport/ -start gc -gc example/gencode.v7.gc.txt

以上的参数只有一个与其说明文档不一样的地方就是使用了-Xmx2048m来指定java虚拟机的内存大小为2G。如果遇到java.lang.OutOfMemoryError，还可以指定得再大些。

当然如果是自己的文件的话，还需要多两步：

1.BAM，reference及GTF文件的基因组名称必须一致。

2.需要使用picard工具包中的CreateSequenceDictionary来构建一个dictionary文件。

原文来自：http://pgfe.umassmed.edu/ou/archives/3050