整个分析用TopHat进行比对，比对完成后将比对输出作为cufflinke拼接的输入（单独拼接），将单独拼接的结果使用cuffmerge混合，然后使用cuffdiff做差异，使用r软件包CummeRbund输出差异比大的相关图形。（目前已经改版有点变化）。
现在改动的部分：
Tophat实际上就是bowtie变体，只不过bowtie只能比对DNA,tophat可以比对RNA，简单就是剪掉过内含子的序列。主要是针对可变剪切的比对，用于RNAseq定量分析，一般存在参考的注释信息。
Tophat网址：http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
需要事先准备的文件有：
参考基因组的fasta文件以及用bowtie建立的index文件
测序数据（fastq）
参考的转录本注释信息（gtf格式）
Usage:
tophat [options]* [reads1_2,...readsN_2]
for example:
tophat -p 8 -G genes.gtf -o C1_R1_thout genome C1_R1_1.fq C1_R1_2.fq
-p 代表线程
-G 代表转录本注释信息
-o 输出文件夹
--segment-length 25 （将redas分成的最小比对片段）
--segment-mismatches 1 （片段比对错配碱基数）
--library-type （是否链特异性）fr-unstranded
—transcriptome-index （转录本的bowtie-index文件）
比对输出文件：
accepted_hits.bam（比对输出）
junctions.bed
insertions.bed and deletions.bed
＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃
cufflinks拼接
Usage: cufflinks [options]*
for example:
cufflinks -p 8 -o C1_R1_clout C1_R1_thout/accepted_hits.bam
cufflinks -p 8 -o C1_R2_clout C1_R2_thout/accepted_hits.bam
cufflinks -p 8 -o C1_R3_clout C1_R3_thout/accepted_hits.bam
cufflinks -p 8 -o C2_R1_clout C2_R1_thout/accepted_hits.bam
cufflinks -p 8 -o C2_R2_clout C2_R2_thout/accepted_hits.bam
cufflinks -p 8 -o C2_R3_clout C2_R3_thout/accepted_hits.bam
建立一个文件命名为：assemblies.txt,assemblies.txt内容如下：
./C1_R1_clout/transcripts.gtf
./C2_R2_clout/transcripts.gtf
./C1_R2_clout/transcripts.gtf
./C2_R1_clout/transcripts.gtf
./C1_R3_clout/transcripts.gtf
./C2_R3_clout/transcripts.gtf
运行Cuffmerge:
cuffmerge -g genes.gtf -s genome.fa -p 8 assemblies.txt -o /merged.gtf
输出产生一个GTF文件:merged.gtf
运行Cuffquant：
Usage:
cuffquant [options]*
参数：-o/—output-dir 输出目录，默认为当前目录
输出文件：abundances.cxb
运行Cuffdiff：（计算每个样本基因、转录本的FPKM）
组与组比较：
cuffdiff --use-sample-sheet
sample_sheet.txt内容如下：
sample_id group_label
C1_R1.sam C1
C1_R2.sam C1
C2_R1.sam C2
C2_R2.sam C2
如果两个条件之间比较：-C
condition_A condition_B
Ctrl Mutant_X
Ctrl Mutant_Y
Ctrl Mutant_Z
名字的命名至少匹配样本名称
以前版本的命令：
cuffdiff -o diff_out -b genome.fa -p 8 –L C1,C2 -u merged_asm/merged.gtf
./C1_R1_thout/accepted_hits.bam, ./C1_R2_thout/accepted_hits.bam,
./C1_R3_thout/ accepted_hits.bam
./C2_R1_thout/accepted_hits.bam,./C2_R3_thout/accepted_hits.bam,./C2_R2_thout/ accepted_hits.bam
（重复用逗号隔开）
原文来自：http://blog.sina.com.cn/s/blog_83f77c940102v7wl.html