【相关概念】
DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱,它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成,以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中,建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节,近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。
构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶,通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。
在酶切图谱制作过程中,为了获得条带清晰的电泳图谱,一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。
【构建策略】
物理图谱(physical map)是在DNA分子水平上描述染色体中界标间顺序和距离的图谱。构建物理图谱的目的是分离和鉴定单个基因或某些感兴趣的基因片段，为人类基因组30 亿个碱基测序打下基础。
构建物理图谱是人类基因组计划的重要组成部分。由于到目前为止末能发明直接对基因组DN A整体水平进行分析检测的技术，所以，只有将基因组DNA切割成小片段后插入不同的生物载 体再转染到一些生物体中使其稳定复制，分析其基因片段拷贝，对克隆群插入DNA片段按其在原始基因组上线性顺序进行排序，构建物理图谱。物理图谱的终极图谱是DNA序列图谱。
与遗传图谱相比，物理图谱的分辨率更高，图谱标记更多。因此，在多数生物中，物理图 谱 比遗传图谱更重要。物理图谱是从遗传图谱到序列图谱的中间图谱，在区域性测序、构建较佳克隆时，没有完整及准确的物理图谱是不能够准确完成测序的。构建精确的物理图谱，可发现和分析相应区域的基因序列，实现DNA测序，从序列中克隆基因。目前，分辨率最高的物理图谱是在序列专一位点(seguence-tagged site,STS)作为标记的基础 上，将插入人类DNA片段的克隆群按原来在染色体基因组上的线性顺序构建的图谱。STS可作为整合遗传图谱和物理图谱的，对采用不同作图技术构建的图谱进行比较 并对其进行整合，最终实现大规模基因组DNA测序。
完整物理图谱的构建策略
一、构建完整物理图谱的基本要素
(1) 界标(marker)
界标是绘制图谱的标记工具。构图方法不同，界标的种类、界 标间的 距离、图谱的分辨率也不同。图谱中的界标包括采用家系分析法构建的遗传图谱中的基 因，DNA原位杂交法构建的遗传图谱中的DNA探针，用RFLP、MS、SNP等作为标记构建遗传图 谱中的DNA多态性。低分辨率的物理图谱界标有STS和cDNA(EST) 。高分辨 率的 物理图谱界标：一是基于STS构图法STSs界标；二是限制性酶切指纹法构图中的限制性酶切 位点界标
(2) 作图单位
根据构图方法确定。限制性内切酶的酶切片段是物理图谱的基本单位。以STS 为路标构建图谱是以STS作为基本单位；以碱基构成的终极物理图谱则以碱基对为基本单位 。
(3) 确定标记顺序
确定标记位点相互之间的衔接关系是制作图谱的主要目的。将全基因组 的 不同界标单位进行排序的方法包括：限制性酶切指纹排序、重叠连续克隆序列(STC)排序、 计算机软件排序、染色体步查和跳查填补间隙排序等。目前，新型技术全基组散弹法或鸟枪 法(shot-gun)可随机对DNA进行大规模测序，即绕过BAC克隆逐个排序过程，直接将基因组DN A分解成2Kb左右的小片段进行随机测序，辅之一定数量的10Kb克隆和BAC克隆末端测序(500b p)，利用超级计算机进行序列组装。
(4) 具有DNA可复制系统
除可见图谱外，其他图谱的构建均需DNA复制系统。包括YAC、BAC 、粘粒、福斯粘粒、M13和P1等载体系统。上述复制系统在组装DNA片段的容量、插入外源DNA后的稳定性、克隆嵌合体以及构建基因文库所需的克隆数量上均不相同。
二、完整图谱构建的步骤
1、分离大片段DNA分子
从染色体显带的低分辨率细胞学作图到限制酶切指纹、重叠克隆群的高分辨率物理图谱，分 离到的DNA片段的大小差异很大，可介于10Mb到100Kb之间。方法是：利用不同的限制性内 切酶将DNA切成长 度不等的片段，通过琼脂糖凝胶电泳法和脉冲电场凝胶法将大到10Mb的DNA片段进行分离 。分离后的DNA片段经直接染色使DNA显带，或通过DNA分子杂交， 使标记放射性同位素或非放射性同位素标记的探针能在数以百万计的不同DNA片段溶液中找 到与其互补的DNA链。虽然这些方法能分离DNA片段，并确定与其相应的探针的顺序，但不能 使分离的DNA片段按染色体上的顺序进行排序。
2、大片段DNA和DNA克隆库排序
把覆盖一条染色体的50—500个大DNA片段进行排序以构建低分辨率图谱的排序方法有两种： 一是用两种不同的限制性内切酶分别切割基因组DNA，可以产生两套彼此重叠的DNA片段，再 用适当的探针将相邻的重叠片段鉴定出来。二是只用一种限制性内切酶产生大片段，再用一 套连点探针(linking probe)与两个不同的大DNA片段杂交，由于探针是由酶切大片段产生的 小片段制成，含有特定酶切位点顺序，所以可确定大段DNA在基因组中的邻近关系。
然而，高分辨率的物理图谱必须采用克隆排序。染色体上DNA片段的克隆是随机的，库中的 每个克隆通常都与相邻的数个克隆有广泛的重叠，克隆库的高度重复使染色体的任一片段将 出现在数个不同的克隆库中。目前，利用克隆库进行高分辨率物理图谱的排序有五种途径：
① YAC是装载DNA片段最大的克隆库，插入外源DNA片段是细菌宿主系统中(BAC)克隆片段的10 倍：
② BAC是一种可取代YAC的新方法，克隆效率高，克隆载体的稳定性好，克隆嵌合体极少；
③ Cosmid作为亚克隆的载体克隆系统，在重叠群连接时起重要作用。代表基因组转录区的 cDNA克隆库可作为另一类确定DNA大片段间衔接关系的探针(cDNA探针)，检测不含内含子的 编码区在基因组中的衔接次序；
④另一类利用经过标准化的家族连锁分析进行排序的FRLP探针套，可将大片段DNA克隆进行 排序。
⑤现有许多指纹法可用来鉴定重叠克隆并排定克隆库次序。
3、克隆间隙的填补方法—染色体步查和染色体跳查
染色体步查和跳查(chromosome walking和chromosome jumping)是寻找重叠克隆和填补克隆 群间隙的有效方法。从染色体上的某一位置(或某一克隆片段)出发，设法分离得到与其邻接 的(一侧或两侧)片段，一步一步地或跳过一定序列，根据末端重叠序列将邻近片段连接起来 。
染色体步查和跳查是Bender W等人于1983年在研究黑腹果蝇(Drosophila mel anogaster)的黄嘌呤脱氢酶和乙酰胆碱酯酶的编码基因Rosy和Ace位点时提出的一种 连接邻近基 因的方法。用含有已鉴定基因的克隆片段末端序列(该序列与邻近DNA片段末端序列相互重叠 )作探针，经分子杂交分离得到相邻序列的克隆，然后用这个克隆片段末端的重叠序列探 出与它相邻的另一个克隆，每做一轮杂交，就可以从已鉴定的基因开始沿着染色体步移一次 。实际上染色体步查是通过相互重叠的克隆之间的一系列杂交来完成的。此法虽是填补空隙的常规方法，但也存在明显的弊端。
(1)由于真核生物基因组存在大量重复，常使步查发生错误；
(2)要求探针为特异性序列和较多的基因克隆库，并要在基因克隆库中做大量筛选工作。
(3)目前的步查最多只能走1000Kb，不可能走完全程。所以大片段的空隙填补有一定局限。