Cufllinks的安装与使用

$ tar jxvf boost_1_53_0.tar.bz2
$ cd boost_1_53_0
$ ./bootstrap.sh
$ sudo ./b2 install

下载SAM tools。
$ tar jxvf samtools-0.1.18.tar.bz2
$ cd samtools-0.1.18
$ make
$ sudo su 
# mkdir /usr/local/include/bam
# cp libbam.a /usr/local/lib
# cp *.h /usr/local/include/bam/
# cp samtools /usr/bin/

下载Eigen
$ tar jxvf 3.1.2.tar.bz2
$ cd eigen-eigen-5097c01bcdc4
$ sudo cp -r Eigen/ /usr/local/include/

$ tar zxvf cufflinks-2.0.2.tar.gz
$ cd cufflinks-2.0.2
$ ./configure --prefix=/path/to/cufflinks/install --with-boost=/usr/local/ --with-eigen=/usr/local/include//Eigen/
$ make
$ make install

$ cufflinks [options]* <aligned_reads.(sam/bam)>
 
一个常用的例子：
$ cufflinks -p 8 -G transcript.gtf --library-type fr-unstranded -o cufflinks_output tophat_out/accepted_hits.bam

-h | --help
-o | --output-dir <sting>  default: ./
    设置输出的文件夹名称
 
-p | --num-threads  default: 1
    用于比对reads的CPU线程数
 
-G | --GTF <reference_annotation.(gtf/gff)>
    提供一个GFF文件，以此来计算isoform的表达。此时，将不会组装新的transcripts，
程序会忽略和reference transcript不兼容的比对结果
 
-g | --GTF-guide <reference_annotation.(gtf/gff)>
    提供GFF文件，以此来指导转录子组装(RABT assembly)。此时，输出结果会包含ref
erence transcripts和novel genes and isforms。
 
-M | --mask-file <mask.(gtf/gff)>
    提供GFF文件。Cufflinks将忽略比对到该GTF文件的transcripts中的reads。该
文件中常常是rRNA的注释，也可以包含线立体和其它希望忽略的transcripts的注释。将这
些不需要的RNA去除后，对计算mRNA的表达量是有利的。
 
-b | --frag-bias-correct <genome.fa>
    提供一个fasta文件来指导Cufflinks运行新的bias detection and correct
ion algorithm。这样能明显提高转录子丰度计算的精确性。
 
-u | --multi-read-correct
    让Cufflinks来做initial estimation步骤，从而更精确衡量比对到genome多个
位点的reads。
 
--library-type  default:fr-unstranded
    处理的reads具有链特异性。比对结果中将会有个XS标签。一般Illumina数据的lib
rary-type为 fr-unstranded。

-m | --frag-len-mean default: 200
插入片段的平均长度。不过现在Cufflinks能learns插入片段的平均长度，因此不推荐自主
设置此值。
 
-s | --frag-len-std-dev default: 80
插入片段长度的标准差。不过现在Cufflinks能learns插入片段的平均长度，因此不推荐自
主设置此值。
 
-N | --upper-quartile-form
使用75%分为数的值来代替总的值(比对到单一位点的fragments的数值)，作normal
ize。这样有利于在低丰度基因和转录子中寻找差异基因。
 
--total-hits-norm default: TRUE
Cufflinks在计算FPKM时,算入所有的fragments和比对上的reads。和下一个参数
对立。默认激活该参数。
 
--compatible-hits-norm 
Cufflinks在计算FPKM时，只针对和reference transcripts兼容的fragmen
ts以及比对上的reads。该参数默认不激活，只能在有 --GTF 参数下有效，并且作 RABT
或 ab initio 的时候无效。

-L | --label  default: CUFF
    Cufflink以GTF格式来报告转录子片段(transfrags),该参数是GTF文件的前缀
 
--min-frags-per-transfrag <int>  default: 10
    组装出的transfrags被支持的RNA-seq的fragments数少于该值则不被报道。
 
--min-intron-length <int>  default: 50
    最小的intron大小。
 
--overlap-radius <int>  default: 50
    Transfrags之间的距离少于该值，则将其连到一起。

列数   列的名称  例子         描述
1     序列名    chrX        染色体或contig名
2     来源      Cufflinks   产生该文件的程序名
3     类型      exon        记录的类型，一般是transcript或exon
4     起始      1           1-base的值
5     结束      1000        结束位置
6     得分      1000        
7     链        +          Cufflinks猜测isoform来自参考序列的那一条链，
一般是'+','-'或'.'
8     frame    .           Cufflinks不去预测起始或终止密码子框的位置
9     attributes  ...      详见下

Attribute      例子       描述
gene_id        CUFF.1    Cufflinks的gene id
transcript_id  CUFF.1.1  Cufflinks的转录子 id
FPKM           101.267   isoform水平上的丰度, Fragments Per Kilobase
 of exon model per Million mapped fragments
frac           0.7647    保留着的一项，忽略即可，以后可能会取消这个
conf_lo        0.07      isoform丰度的95%置信区间的下边界，即 下边界值 =
 FPKM * ( 1.0 - conf_lo )
conf_hi        0.1102    isoform丰度的95%置信区间的上边界，即 上边界值 =
 FPKM * ( 1.0 + conf_hi )
cov            100.765   计算整个transcript上read的覆盖度
full_read_support   yes  当使用 RABT assembly 时，该选项报告所有的intr
ons和exons是否完全被reads所覆盖

$ cuffmerge [options]* <assembly_GTF_list.txt>
输入文件为一个文本文件，是包含着GTF文件路径的list。常用例子：
$ cuffmerge -o ./merged_asm -p 8 assembly_list.txt

-h | --help
-o <output_dir> default: ./merged_asm
将结果输出至该文件夹。
 
-g | --ref-gtf
将该reference GTF一起融合到最终结果中。
 
-p | --num-threads <int> defautl: 1
使用的CPU线程数
 
-s | --ref-sequence <seq_dir>/<seq_fastq>
该参数指向基因组DNA序列。如果是一个文件夹，则每个contig则是一个fasta文件；如果是
一个fasta文件，则所有的contigs都需要在里面。Cuffmerge将使用该ref-sequence来
帮助对transfrags分类，并排除repeats。比如transcripts包含一些小写碱基的将归类
到repeats.

$ cuffcompare [options]* <cuff1.gtf> [cuff2.gtf] ... [cuffN.gtf]
 
使用例子：
$ cuffcompare -o cuffcmp cuff1.gtf cuff2.gtf

-h
-V
-o <outprefix> default: cuffcmp
输出文件的前缀
 
-r <reference_mrna.gtf>
参考的GFF文件。用来评估输入的gtf文件中gene models的精确性。每一个输入的gtf的is
oforms将和该参考文件进行比较，并被标注为 overlapping, matching 或 novel。
 
-R
当有了 -r 参数时，指定该参数时，将忽略参考GFF文件中的一些transcripts。这些tran
scripts不和任何输入的GTF文件overlapped。
 
-s <seq_dir>/<seq_fastq>
该参数指向基因组DNA序列。如果是一个文件夹，则每个contig则是一个fasta文件；如果是
一个fasta文件，则所有的contigs都需要在里面。小写字母的碱基用来将相应的transcri
pts作为repeats处理。

$ cuffdiff [options]* <transcripts.gtf> <sample1_1.sam[,...,sample1_M.sam]> <sample2_1.sam[,...,sample2_M.sam]>...[sampleN_1.sam[,...,sampleN_M.sam]]
其中transcripts.gtf是由cufflinks，cuffcompare，cuffmerge所生成的文件，或是由其它程序生成的。
 
一个常用例子：
$ cuffdiff --lables lable1,lable2 -p 8 --time-series --multi-read-correct --library-type fr-unstranded --poisson-dispersion transcripts.gtf sample1.sam sample2.sam

-h | --help
-o | --output-dir <sting> default: ./
输出的文件夹目录。
-L | --lables <lable1,lable2,...,lableN>  default: q1,q2,...qN
给每个sample一个样品名
 
-p | --num-threads <int> default: 1
使用的CPU线程数
 
-T | --time-series
让Cuffdiff来按样品顺序来比对样品，而不是对所有的samples都进行两两比对。即第二个
SAM和第一个SAM比；第三个SAM和第二个SAM比；第四个SAM和第三个SAM比...
 
-N | --upper-quartile-form
使用75%分为数的值来代替总的值(比对到单一位点的fragments的数值)，作normalize。
这样有利于在低丰度基因和转录子中寻找差异基因。
 
--total-hits-norm default: TRUE
Cufflinks在计算FPKM时,算入所有的fragments和比对上的reads。和下一个参数对立。
默认激活该参数。
 
--compatible-hits-norm
Cufflinks在计算FPKM时，只针对和reference transcripts兼容的fragments以及
比对上的reads。该参数默认不激活，只能在有 --GTF 参数下有效，并且作 RABT 或 ab
 initio 的时候无效。
 
-b | --frag-bias-correct
提供一个fasta文件来指导Cufflinks运行新的bias detection and correction 
algorithm。这样能明显提高转录子丰度计算的精确性。
 
-u | --multi-read-correct
让Cufflinks来做initial estimation步骤，从而更精确衡量比对到genome多个位点
的reads。
 
-c | --min-alignment-count <int>  default: 10
如果比对到某一个位点的fragments数目少于该值，则不做该位点的显著性分析。认为该位点
的表达量没有显著性差异。
 
-M | --mask-file <mask.(gtf/gff)>
提供GFF文件。Cufflinks将忽略比对到该GTF文件的transcripts中的reads。该文件中
常常是rRNA的注释，也可以包含线立体和其它希望忽略的transcripts的注释。将这些不需
要的RNA去除后，对计算mRNA的表达量是有利的。
 
-FDR <float> default: 0.05
允许的false discovery rate.
 
--library-type default:fr-unstranded
处理的reads具有链特异性。比对结果中将会有个XS标签。一般Illumina数据的library-
type为 fr-unstranded。
 
-m | --frag-len-mean default: 200
插入片段的平均长度。不过现在Cufflinks能learns插入片段的平均长度，因此不推荐自主
设置此值。
 
-s | --frag-len-std-dev default: 80
插入片段长度的标准差。不过现在Cufflinks能learns插入片段的平均长度，因此不推荐自
主设置此值。
 
--poisson-dispersion
Use the Poisson fragment dispersion model instead of learning one 
in each condition.